白刺种子无菌苗培养中不同灭菌方法对比

于 倩，张得芳 *，史文君

(1.青海大学农林科学院，青海 西宁 810016；2.青海大学，青海省高原林木遗传育种重点实验室，青海 西宁 810016)

白刺(Nitrariatangutorum)，蒺藜科白刺属灌木，多生长于荒漠和半荒漠的湖盆沙地等[1]，分枝密，根系发达，抗旱、抗风沙、耐盐碱[2]，具有较强的阻风固沙能力[3]，其果实具有降血脂、降血压、调节血糖、抗疲劳、提高免疫力等功效，在医药方面也前景较好[4]。现阶段白刺多通过播种或扦插进行人工繁殖，但种子繁殖生长速度较缓慢，扦插受季节和植物生理周期等因素限制，而植物组织培养可不受环境条件和生长周期的影响达到快速生长、稳定遗传的效果，因此白刺组培技术迅速兴起。植物组织培养技术现已在育种、制药等多方面快速、成熟发展[5-6]，但在实际操作中多种因素都能造成失败。合适的灭菌时间和溶液配比可以降低种子的污染率并提高成活率[7-8]；使用分化能力强、内生菌较少的植物组织作为外植体[9]，可更大程度地降低污染的风险。目前，植物组织培养的研究主要集中在培养基筛选、外植体筛选、激素配比等方面[10]，针对外植体灭菌处理的研究较少。白刺的快繁技术大多以茎段、枝条为外植体，但因其植株内生菌种类多而复杂，为组织培养造成诸多困难，其种子经沙埋低温处理后微生物数量大大减少，且使用种子作为材料进行组织培养具有不受时间限制、繁殖较快的优点，是优良的外植体材料。

本试验以白刺种子为材料，通过不同灭菌方式之间的对比研究，选择低污染、高效率的灭菌处理方法，以达到快速获取无菌苗的要求，为后期白刺组织培养的其他方面研究奠定基础[11]，以便于白刺的高效优质繁殖。

1 材料与方法

1.1 试验材料

实验材料为白刺种子，采自青海省柴达木盆地。经过沙埋、低温冷藏30d处理后，挑选颗粒饱满、无病虫害的种子作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 试验设计

对不同灭菌因子(75%酒精、0.1%升汞溶液、不同浓度次氯酸钠溶液)进行随机正交实验设计，取筛选后的试验材料，按照设计分别对白刺种子进行灭菌处理，灭菌后将种子点播在装有80ml MS固体培养基的500ml培养瓶内，每瓶点播6粒种子，重复5次。将接种后的培养基放置在温度湿度恒定的培养室内，观察并记录种子的灭菌效果。

1.2.2 种子灭菌处理

取适量沙藏后白刺种子洗净，清水冲洗后晾干收集备用。接种前对种子进行消毒，设置“75%酒精、0.1%升汞溶液”和“75%酒精、不同浓度次氯酸钠溶液”共62种灭菌处理，随机组合(表1)。先用75%酒精浸泡，均匀摇晃，使其与酒精充分接触；用清水清洗；再加入次氯酸钠溶液，保持均匀摇晃一定时长；最后再用灭菌后的超纯水反复清洗五次，将种子倒在干净的培养皿中，供接种使用。以上灭菌操作均在超净工作台中进行。

表1 灭菌处理试验设计Table.1 Sterilization test design

1.2.3 培养条件

白刺接种采用MS培养基，不添加任何激素。称4.43g MS培养基粉末和30g蔗糖倒入1L的锥形瓶中，加水定容至1L，再用15%氢氧化钠溶液调节pH=5.9-6.0，最后加入7g琼脂粉末，摇晃均匀；将洗干净的培养瓶和装有培养基溶液的锥形瓶放入高压灭菌锅中，121℃ 15min；在超净工作台中进行培养基溶液的分装，保持培养基厚度0.5-1cm左右，静置1h左右培养基凝固。24h光照培养，温度为26±1℃。培养阶段若发生培养基或外植体污染，及时将未污染种子接种到新培养基中，继续观察。

1.2.4 数据记录及分析

数据处理中所需公式为：

污染率(%)=污染的种子个数/接种的种子总数×100%；

成活率(%)=发芽的种子个数/接种的种子总数×100%。

试验数据采用Microsoft Excel 2010进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌处理对种子污染率的影响

表2 不同灭菌处理对种子的影响

白刺种子的灭菌试验结果如表2所示，所有处理中，污染率最高达到100%，最低为0，平均来看，15d污染率为16.56%，30d污染率为23.55%。相同处理条件下，灭菌时间越长，种子污染率大多越低，灭菌效果越好；75%酒精消毒60s的灭菌效果普遍优于消毒30s，污染率更低；经相同处理的75%酒精消毒后，升汞溶液灭菌的效果优于次氯酸钠溶液，均低于15%，且次氯酸钠溶液浓度越低灭菌效果越差，种子污染率越高。根据15d和30d种子污染率对比可知，升汞溶液消毒效果比较稳定，极少数处理组继续污染，次氯酸钠溶液处理后的材料仍在扩大污染。综合分析可知，可选取的处理组合为“75%酒精、升汞溶液”和“75%酒精、高浓度次氯酸钠溶液”，即A1-A6、B16-B25、C1-C6、D6-D25处理组。

2.2 不同灭菌处理对种子成活率的影响

由表2可知，种子存活率最高可达80%，最低为0%，15d成活率的均值为32.42%，30d为35.59%。相同处理条件下，种子成活率与处理时长无明显关系；60s 75%酒精消毒的种子成活率普遍高于30s的消毒处理，可能是因为消毒效果较好，利于种子正常生长；相同时间的75%酒精灭菌下，由于升汞溶液自身毒性过强，再使用升汞溶液消毒后的种子成活率明显低于次氯酸钠溶液消毒；低浓度(10%、20%)次氯酸钠溶液消毒后的种子污染率高，种子无法正常生长萌发，致使其发芽率低；相同酒精消毒后，次氯酸钠溶液浓度越高，成活种子数量越多。对比种子生长15d和30d的结果可知，白刺种子生长较为稳定，只有少数处理下种子成活率增长，且涨幅很小。综合分析，“75%酒精、高浓度次氯酸钠溶液”即B16-B25、D6-D25处理后对白刺种子的生长影响不大，成活率较高。

2.3 不同灭菌处理对种子起始发芽天数的影响

种子发芽受很多因素影响，根据表2可知，消毒后的白刺种子多数在7d内开始发芽生长；经升汞溶液消毒后的种子发芽时间较晚，升汞溶液的毒性影响种子自身生长机制，处理时间过长或导致种子死亡，即C6处理组30d内始终无生长发芽迹象；经次氯酸钠溶液消毒的白刺种子，其发芽受污染率影响，污染率越高，种子普遍萌发较晚，生长缓慢；75%酒精消毒时间越长，种子萌发越快。所以，较好的处理组合为“75%酒精60s、次氯酸钠溶液”，即C1-C6、D1-D25。

3 讨论

综合各项指标，本试验最终选取低污染率、高成活率、发芽快速的处理组合D20、D23、D25为白刺种子组织培养的灭菌方法，即“75%酒精60s、40%次氯酸钠溶液30min”、“75%酒精60s、50%次氯酸钠溶液20min”、“75%酒精60s、50%次氯酸钠溶液30min”，其中“75%酒精60s、50%次氯酸钠溶液30min”处理后的白刺种子培养过程中污染率为0，为最佳灭菌条件。

植物组织培养过程中，培养基内营养充足，光照温度等条件适宜，在促进植株生长的同时也会导致微生物在短时间内的快速、周期性繁殖，常会发生材料污染导致试验失败等情况，不仅会直接影响植物的正常生长发育，还会间接造成组培材料的浪费[12]。为了有效地避免污染，操作人员需提高对各阶段的处理和操作的重视程度[13]。目前，关于白刺组培快繁的研究很少[14]，且基本都以茎尖、枝条等为材料，存在组培苗纤弱[15]、增值率较低[16]等问题，常用的灭菌方法为75%酒精和0.1%升汞溶液相结合，但仍会有污染，灭菌效果不佳[17]。外植体的无菌培养是植物组培的关键条件[18]，白刺枝条大量的内生菌致使白刺组织培养过程中污染率极高，茎段或叶片的组培快繁难度较大，相比之下，种子内微生物种类、数量较少，在消毒灭菌后进行组培可大大降低种子及培养基的污染，使得白刺种子的组织培养变得尤为重要和有效。在其他植物的组培过程中，以不同植物的种子为外植体进行无菌苗培养采用的灭菌条件有所差异，一般以0.1%升汞溶液为第二阶段的消毒条件为主，也有部分植物使用适当浓度的次氯酸钠溶液进行灭菌处理，防止升汞溶液毒性过强对后期组培苗萌发、生长产生影响。任艳[19]研究花生的组织培养技术结果发现，用75%酒精浸泡0.5-1min、1%次氯酸钠溶液浸泡10min进行消毒，灭菌效果最好且对种子的伤害较小；刘洁云[20]以红色长春花种子为材料，得出其最佳灭菌处理为以10%次氯酸钠溶液处理10min；陈灿[21]以野生白芨种子为材料建立快繁体系，研究结果表明其灭菌方案是先用清水冲洗加入洗洁剂的种子，再以75%酒精30s、0.1%升汞溶液15min进行处理；唐丽丹[7]以紫薇顶芽、叶片、蒴果等不同部位为材料分别进行“75%酒精、0.1%升汞溶液”的消毒处理，研究表明灭菌时间因植株部位不同而变化，且植株易褐化；李蕊萍[22]以红锥种子为外植体建立无菌系，得出较好的灭菌方案为剥掉种皮、75%酒精40s、0.1%升汞溶液6min；蒋时姣[23]研究柳杉的优良无性系快繁体系得出，以种子为外植体，进行75%酒精20s、0.1%升汞溶液10min的消毒处理，其污染率最低为10.00%，效果较好；陈章靖[24]研究玛咖组培再生系统，得到的最佳灭菌方法为对种子进行0.1%升汞溶液6min处理，存活率可达到92%；胡佳丽[25]通过以种胚为材料的组织培养对铁皮石斛进行快繁，发现使用75%酒精30s、8.0%次氯酸钠溶液8min的灭菌方法效果最佳，且与传统的升汞溶液灭菌相比更安全，能够更好地维持铁皮石斛的药用价值，保证其培育、使用的安全性；李玲莉[26]以柔枝松合子胚为外植体材料进行组培，得到的最佳灭菌方法是20%次氯酸钠溶液20min浸泡处理，在不损伤种子的前提下，达到最低污染率。

升汞溶液和次氯酸钠溶液在消毒处理上各有利弊，前者灭菌较为彻底，且短时、高效，但因其毒性往往在应用时较为受限，后者虽灭菌成分温和，存在一定程度灭菌不彻底的情况，但对植株本身的危害不大，能够使幼苗较为稳定地生长快繁，且使用适当浓度的次氯酸钠溶液，加长消毒时间，也能达到类似升汞溶液的灭菌效果。本实验旨在研究筛选以白刺种子为材料进行组织培养的最佳灭菌组合，也为后期白刺组培快繁、培育推广提供一定的理论基础。

4 结论

为研究白刺种子的最佳灭菌条件，本试验以“75%酒精+次氯酸钠溶液”和“75%酒精+升汞溶液”两种组合，对白刺种子进行不同浓度梯度的研究，通过对接种后污染率、种子成活率以及发芽时间的综合分析，得出灭菌效果最好的方案为“75%酒精60s、50%次氯酸钠溶液30min”。 具体操作为，将春化后的白刺种子先用75%酒精灭菌60s，用无菌水冲洗1次，再用50%次氯酸钠溶液消毒30min，无菌水冲洗3-5次，将处理后的种子转移到灭菌的培养皿中，再接种到厚度合适的培养皿上，此时白刺种子的污染率最低，存活率高，且发芽较快。