Gremlin促血管生成作用的研究进展

谢宇欣 综述 石国庆 审校

遵义医科大学附属医院，贵州 遵义563000

血管生成是由组织中既存的成熟血管的内皮细胞发生增殖和游走，形成小的血管，包括一系列步骤：(1)原有血管基底膜降解并引起毛细血管芽的形成和细胞迁移；(2)内皮细胞向刺激方向迁移；(3)位于迁移细胞后面的内皮细胞增殖和发育成熟。所有这些步骤均由生长因子、细胞和细胞外基质间的相互作用所调控。血管生成在各种生理和病理条件下起着关键作用，如损伤修复、炎症、肿瘤生长等。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管形成中发挥特殊作用。在发育成熟组织的生理性血管新生(如子宫内膜增殖)和病理性血管新生(如慢性炎症、创伤愈合、肿瘤、视网膜病变、早熟等)过程中，VEGF作用最为重要。VEGF受体包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，三者均属于酪氨酸激酶受体。VEGF-VEGFR是血管生成的经典途径信号通路。而近年来的研究发现Gremlin是一种新型的VEGFR2激动剂，因此，Gremlin作为一种新型促血管生成因子，Gremlin-VEGFR2是血管生成的非经典途径信号通路。本文就Gremlin通过VEGFR2途径促血管生成作用的研究进展做一综述。

1 Gremlin的结构与功能

1.1 骨形态形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)拮抗剂Gremlin基因在物种间高度保守，属于胱氨酸结超家族，其编码3种蛋白质，分别为Gremlin-1、Gremlin-2、Gremlin-3。Gremlin-1是一种由骨髓间充质干细胞分泌的BMP拮抗剂，通过抑制BMP/Smad信号通路，调节胚胎发育过程中器官体征的形成以及骨骼发育，也可抑制肿瘤干细胞分化。有研究发现BMP-Gremlin信号通路在肾脏和尿路的胚胎发育、成骨细胞分化、肾功能和纤维化疾病进展中起了重要作用[1]，比如后肾间充质中需要大量的BMP-4抑制剂Gremlin-1来促进输尿管芽的生长和上皮分支的形态发生[2]。此外，Gremlin-1还被证明可以通过激活典型的TGFβ信号加重由高浓度葡萄糖引起的足细胞损伤，这表明Gremlin可能在肾脏疾病的发生或发展中起作用[3]；人类Gremlin-2基因在胚胎发育过程中,通过激活JNK信号通路，促进胚胎干细胞向心房分化以及调节心房正常节律[4]。目前对Gremlin-3的机制研究尚不清楚。

1.2 血管内皮生长因子受体2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)激动剂 在血管生成实验中，发现加入纯化的BMP拮抗剂Gremlin可诱导内皮细胞发芽、迁移和侵袭[5]。因此，Gremlin是一种新型血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)激动剂，也是一种促血管生成因子，作为VEGFR2的活化配体发挥血管生成作用，促进内皮细胞增殖和血管形成[6]，它是目前已知的唯一能高亲和力结合并激活VEGFR2，从而促进血管生成的CAN[7]。Gremlin既可作为单体存在，又可作为同型二聚体存在。单体Gremlinc141a是一种新型的VEGFR2拮抗剂，并结合VEGFR2导致与受体的非生产性相互作用，由于缺乏诱导受体二聚和内化的能力，所以单体Gremlinc141a缺乏促血管生成活性[8]。鉴于VEGFR2二聚并在与VEGF结合时激活，很容易推测Gremlin作为同型二聚体时，可以发挥血管生成功能[9-10]。Gremlin结合VEGFR2，诱导VEGFR2自磷酸化，激活PI3K/Akt-mTOR和Ekr-MAPK信号通路，促进血管增殖[7]，这种作用可能是通过Gremlin与内皮细胞表面硫酸肝素蛋白多糖的相互作用来实现的[11]。此外，αvβ3-整合素和αvβ3-整合素-VEGFR2复合物的形成也被证明参与了Grem1介导的血管生成作用[12]。所以，这些功能与经典的血管内皮生长因子配体的作用高度相似，提示其作为血管内皮生长因子模拟物的作用方式。

2 Gremlin促血管生成作用与脏器的关系

2.1 肾脏Gremlin在正常成人肾脏组织中几乎不表达，在各种肾脏疾病组织中表达增加，主要位于肾小管间质纤维化的区域。Gremlin通过VEGFR2和Notch通路激活调节肾小管上皮间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)过程，从而参与肾纤维化的发生[13]。LAVOZ等[14]从细胞水平和基因水平，发现Gremlin以不依赖于BMPs方式，与细胞中的VEGFR2结合发生磷酸化反应诱导近端肾小管上皮细胞的VEGFR2信号通路持续激活，从而诱导肾脏炎症发生，特异性VEGFR2激酶抑制剂SU5416阻断VEGFR2的激活，明显减轻了肾脏炎症。MEZZANO等[15]述了Gremlin激活肾小管间质细胞中的VEGFR2信号通路，引发了一个与肾脏炎症反应相关的下游机制，即通过激活NF-κB信号通路调节肾脏炎症。CORSINI等[16]证明Gremlin通过诱导一氧化氮(NO)的产生和细胞内cAMP增加，导致内皮细胞通透性升高、细胞间黏附分子增多，诱导内皮细胞产生促炎症反应，从而引起VEGFR2介导的环腺苷磷酸-反应元件结合蛋白(CREB)激活。因此内皮细胞可能通过CREB的激活以及转录因子NF-κB的激活而启动促炎症、促血管生成的转录程序，调节各种血管生成因子的产生。同时MARCHANT等[17]发现，对小鼠施用Gremlin会诱导肾脏中炎性细胞出现并上调促炎性基因，从而认为促炎基因上调与其促血管生成反应密切相关。在肾纤维化疾病中，Grem1水平升高，包括急性肾损伤、糖尿病性肾病、慢性同种异体移植肾病和免疫性肾小球肾炎。Gremlin通过VEGFR2和Notch通路激活调节肾小管上皮间充质转化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)过程，从而参与肾纤维化的发生[13]。CHURCH等[2]发现肾小管上皮细胞特异性Grem1靶向缺失小鼠对叶酸诱导的血管损伤具有保护作用，即Gremlin过表达的转基因小鼠对肾损害的易感性增加。CAROLINA等[18]通过给小鼠注射Gremlin制造糖尿病肾病模型，加入VEGFR2激酶抑制剂后pVEGFR2水平明显减低，降低了肾小球滤过屏障通透性，有助于减少蛋白尿，改善肾功能。

2.2 皮肤 皮肤伤口愈合是高度受控的细胞、体液和分子机制参与的动态过程，大致可分为3个相互重叠的阶段：急性炎症期、肉芽组织生成期、基质形成和重塑期[19]。瘢痕形成是成人皮肤伤口愈合的主要形式。瘢痕修复是肉芽组织转化为以胶原纤维为主的瘢痕组织的过程。刘玉芳等[20]发现，在人体瘢痕组织中，Gremlin、高迁移率族蛋白B1与血管内皮生长因子的表达明显高于正常组织，而骨形态发生蛋白7的表达呈显著性下调。因此，Gremlin的过度表达和骨形态发生蛋白7的表达下调，以及高迁移率族蛋白B1与血管内皮生长因子的高表达可能共同促进炎症修复、纤维化形成，但具体分子机制尚待进一步研究。

紫外线辐射是皮肤癌的致病因素，JI等[21]研究表明，Gremlin明显减弱了紫外线所致的角质形成细胞和成纤维细胞凋亡，而且还激活VEGFR2-PI3K/AKT-Nrf2信号通路，抑制了紫外线诱导的角质形成细胞和成纤维细胞的活性氧产生和DNA损伤，加入VEGFR2抑制剂SU5416后阻断了Gremlin的抗凋亡作用和VEGFR2磷酸化作用。因此，Gremlin可以作为一种新型的抗紫外线皮肤保护剂避免人类皮肤角质形成细胞受紫外线辐射。

2.3 心脏 人体大多数组织和器官在损伤后的再生能力非常有限。因此，包括心脏疾病在内的许多退化性疾病，组织受损后是不能再生的。心脏前体细胞移植可促进新血管生成、改善心肌梗死后的左室功能。Notch1、Jagged1这两个分子已被证明在血管生成中发挥重要作用，而且Notch信号在调节心肌细胞增殖方面也起着重要作用，因此这两个分子对损伤后的心脏再生起重要作用。相关研究发现，Grem2通过Smad2/3信号通路介导Notch1/Jagged1信号通路的激活促进间充质干细胞向心肌细胞分化，从而改善心梗后左室重塑，延长生存期限，降低心脏病的病死率[22]。此外，Grem2被证明可以通过激活c-Jun-N末端激酶通路诱导胚胎干细胞分化为具有心房特征的心肌细胞[4]。因此，Grem2对于心脏发育和心肌细胞分化是必不可少的，而且Grem2表达是由心脏损伤诱导的。

2.4 肺动脉高压Gremlin在正常气道的发育和胚胎肺循环中发挥了关键作用[23]。COSTELLO等[24]通过量化整个胚胎肺中转录物水平，发现Gremlin的表达呈动态变化，即在小鼠胚胎肺中观察到gremlin相对高的表达水平，而在囊状期，当间隔结构形成足以产生充足的肺泡面积进行气体交换时，Gremlin表达明显降低。慢性低氧性肺疾病常因肺动脉高压复杂化。在肺动脉高压的多种病理改变如新生内膜形成中均存在血管生成改变，与患者预后密切相关。在体和离体实验均表明，Gremlin直接与VEGFR2结合，促进人微血管内皮细胞血管生成[24]。Gremlin作为内皮细胞释放因子，与内皮标志物vWF共表达，在慢性缺氧SU5416建立的肺动脉高压小鼠模型中Gremlin-1的RNA表达明显高于对照组，且抗Gremlin-1单克隆抗体减少肺血管重构[6]。内皮细胞的BMP信号是维持正常的肺血管结构必不可少的[25]。研究发现Gremlin-1可能是肺动脉高压一个新的生物标志物，肺内皮细胞的BMP信号通路与NO通路有交联，而Gremlin-1拮抗BMP作用可能导致肺动脉高压患者的NO信号通路受抑制，使中膜增厚、微血管重塑和血管周围纤维化[26]。

2.5 视网膜病变 早产儿视网膜病变(Retinopathy of prematurity，ROP)是早产儿特有的血管增生性视网膜病变，分两个阶段进行，第一阶段开始于视网膜血管的延迟生长和现有血管部分退化，然后第二阶段是缺氧诱导病理性血管生成[27]。ROP模型小鼠的视网膜中，Gremlin表达明显上调，视黄酸含量明显升高(与血管内皮生长因子表达上调相关)，因此Gremlin表达上调与VEGF表达有关。LIU等[28]发现，在视网膜色素上皮(Retinal Pigmentation Epithelial,RPE)细胞中，Gremlin激活VEGFR2-Akt-mTORC2信号通路，促进细胞增殖、迁移和VEGF的产生，因此抗Gremlin疗法可能是ROP及其他增殖性视网膜病的替代疗法。增殖性玻璃体视网膜病变(Proliferative vitreoretinopathy，PVR)是由孔源性视网膜脱离引起的严重并发症，也是视网膜脱离手术失败的主要原因，其生理学特征是RPE细胞增殖、迁移和细胞外基质分子(如纤连蛋白和I型胶原蛋白)分泌增加，多种细胞因子和生长因子参与纤维化膜的形成。在本研究中，Gremlin促进RPE细胞增殖以及I型胶原和纤连蛋白的表达，而且在RPE细胞中，用siRNA沉默Gremlin基因表达可明显抑制TGF-β1和TGF-β2诱导的I型胶原和纤连蛋白的表达。这些发现表明，Gremlin可能在PVR的发展中起重要作用[29]。

2.6 子宫内膜异位症 子宫内膜异位症是一种良性状态，据报道，血管生成是该病的主要特征，该病对新的血管生成有很大的依赖性，然而，血管生成在该病中的潜在机制尚不清楚。Gremlin-1在子宫内膜异位症的血管生成方面起重要作用，而且抗Gremlin-1单克隆抗体的免疫原性强，具有靶向作用，可用于制备筛查子宫内膜异位症的试剂盒[30]。同时SHA等[31]研究表明，Gremlin-1在患者的异位子宫内膜的异常血管生成中起一定作用，外周血清中的GREM1水平可能是子宫内膜异位症的前瞻性血清生物标志物。关于Gremlin在本病中与血管生成的机制研究目前仍是空白。

2.7 肝纤维化 肝纤维化是一种代偿性修复反应，各种病因的慢性肝脏疾病均可导致肝纤维化的发生。病理性血管生成似乎与慢性肝病的纤维化进程具有内在联系，最终导致肝硬化和肝癌等相关并发症的发展。Gremlin是一种促纤维化因子，与肝纤维化等疾病有关[32]。刘汇等[33]通过构建缺氧复合脂肪性肝炎大鼠模型，发现新生血管促进了肝纤维化的形成，但具体机制仍是未知。

2.8 肿瘤 血管生成对原发性肿瘤生长及转移至关重要，因此抗血管生成治疗被认为是一种主要的抗癌治疗方式[34]。GREM1是一种新型的促血管生成因子。GREM1的增加导致结肠癌易感综合征-家族性幼年性息肉病形成，但是对于GREM1在结肠癌的表达及其相关功能的研究还很少。LIU等[35]研究发现，GREM1通过激活一个类似于VEGF-VEGFR的途径，与VEGFR2结合，激活血管生成相关通路，从而诱导血管生成。此外，GREM1还可以在不依赖VEGF的情况下产生相应的促血管生成作用。所以，GREM1在癌细胞中具有自我更新能力。而且大肠癌(Colorectal Cancer，CRC)还可以通过VEGF非依赖性途径分泌GREM1来促进肿瘤生长和血管生成。在结直肠癌细胞中，沉默GREM1通过BMP/SMAD信号通路和VEGF非依赖性途径，抑制细胞增殖、迁移、血管生成和上皮间质转化。大部分(44%)的结直肠癌病例表现为间质型GREM1，这与CRC患者淋巴管浸润减少和临床疗效改善密切相关，这提示基质GREM1是潜在的生物标志物，可能是治疗CRC的靶向疗法[36]。CHEN等[37]对35例胰腺神经内分泌肿瘤的GREM1免疫组化表达和微血管密度(MVD)进行检测，发现GREM1和高MVD的表达是重要且有利的预后因素，而且GREM1表达与高MVD明显相关。GREM1的表达与肿瘤相关的血管生成有关，被认为是胰腺神经内分泌肿瘤的一种新的预后标志物。血管生成在垂体肿瘤生长中起重要作用，目前阻断肿瘤血管形成的尝试主要集中在靶向VEGF-VEGFR信号通路上。KOKOKETSU等[38]研究认为，Gremlin在垂体腺瘤组织中的高表达和CD34阳性血管的强相关性表明Gremlin与垂体腺瘤细胞的血管生成有关。SHAIK等[39]对弥漫性桥脑胶质瘤(Diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG)患儿的研究表明，重组Gremlin-1可以激活人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)和人脑微血管内皮细胞(Human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)中的AKT表达，增加血管内皮细胞的成管能力。

3 结语

综上所述，以上相关研究表明，Gremlin促进血管生成、炎症修复、纤维化及肿瘤细胞增殖、迁移和上皮-间质转化，目前相关分子机制主要与VEGFR2-PI3K/AKT通路、NO通路等有关，因此，Gremlin可能是新的生物标记物，为临床提供治疗靶点或者诊疗方案，但具体作用机制仍需深入研究。