移植性肺癌动物模型建立的研究进展

郑伟珍 综述 吴爱兵，杨志雄 审校

1.广东医科大学附属医院肿瘤中心，广东 湛江524000；2.湛江中心人民医院，广东 湛江524000

肺癌是最常见的癌症类型(占病例总数的11.6%)和癌症死亡的主要原因(占癌症死亡总数的18.4%)[1]。为更好了解肺癌临床发病特征以及制定出更好、更有效的诊治措施，为还原与人肺癌病因、发病机制、发展过程，需要精准模拟肺癌病理过程的动物模型。本文就目前国内外报道的肺癌移植性模型的构建方法的研究进展进行综述，以期为肺癌相关研究提供模型参考。

1 实验动物的选取

选取适合的实验动物对肺癌动物模型的建立具有重要意义。用于肺癌造模的实验动物大多为免疫缺陷动物，如免疫缺陷小鼠、大鼠、兔、犬等。目前用来研究肺癌模型建立的品种主要有：(1)正常鼠，BALB/C-裸小鼠，C57BL/6J小鼠；(2)免疫缺陷鼠：裸鼠、严重联合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，NOD-SCID小鼠，CB.17 SCID小鼠，无胸腺大鼠等。C57BL/6小鼠、裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠都是构建移植性肺癌转移模型的常用品种，具体选择哪种类型的小鼠建模，需要充分考虑实验目的、实验周期、接种方法以及检测指标等因素。这几种品系小鼠各有优势，其中C57BL/6小鼠具有正常的免疫功能，价格低廉、耐受性强，模型成熟，常用于Lewis细胞的肺癌转移建模型构建。裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠常用于人源肺癌细胞的移植性种植，小鼠成瘤率与其种类、免疫特性有着密不可分的联系。阙祖俊等[2]将人源肺癌循环肿瘤细胞CTC-TJH-01(1×106个/只)采用尾静脉注射的方法，注射后第8周NOD/SCID小鼠首次观察到肺部成瘤，第10周NOD/SCID小鼠肺部成瘤率为100%，而在Nude小鼠和C57BL/6小鼠体内均不成瘤。吴健彬等[3]研究显示NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率为55.6%，高于BALB/c裸鼠的成瘤率，并且肺癌在NOD/SCID小鼠易发生肺转移与骨转移，NOD/SCID小鼠仍然是移植性肺转移模型的首选品系。其可能的原因是小鼠的免疫排斥反应被人源肺癌循环肿瘤细胞的较强的免疫原性激发。Nude小鼠由于无胸腺，因此T淋巴细胞所占百分比很低，但具备B淋巴细胞及NK细胞的正常功能。C57BL/6小鼠、BALB/c裸鼠为免疫水平正常小鼠；而NOD/SCID小鼠是联合免疫缺陷小鼠，其体内T、B淋巴细胞和NK细胞的表达极低，因而较适用于异种移植造模。

2 肺癌动物模型分类

目前主要有以下三种模型用于肺癌动物建模的研究：

2.1 诱发性肺癌动物模型 其优点是具有跟人肺癌相似的形态学、组织学以及分子生物学特征，更贴近肺癌实际发生发展原理。主要方法包括吸入、口服致癌剂以及肺或支气管灌注或肺或支气管黏膜下注射致癌物诱发肺癌等。YE等[4]在气管内滴注碘油混悬液(I)和DEN，成功诱导出肺部肿瘤。近年来国外常采用此方式建模，应用于肿瘤相关预防药物的开发实验。但因为该方法构建较困难，诱导时长难以统一，肿瘤形成效率低，难以开展大规模研究。

2.2 转基因肺癌模型 基因工程模型建模耗资较多、时间较长，少见相关报道。

2.3 移植性肺癌动物模型 在实验动物体内接种肿瘤细胞或组织构建而成的肿瘤动物模型即为移植性模型。移植性模型能在同种或相近物种中反复移植，长时间保存以备研究所需，而且可批量接种等量的肿瘤细胞或组织于动物体内，增殖快慢相对统一，动物间区别较小，成瘤率高，研究所需时间较短，研究条件易调节，所以被普遍应用。但移植性动物模型难以用于早期肿瘤发生发展机制的相关研究。以研究目的、造模方式的差异为根据，可将移植性肺癌动物模型进行分类：如按接种部位，可分为原位移植模型和异位移植模型；按照肿瘤细胞的来源，可分为诱发性、自发性、移植性和转基因动物模型等；按照转移部位，可分为脑、骨、淋巴转移模型。

2.3.1 异位移植模型 将肺癌细胞或组织接种于实验动物皮下或肾包膜下或血管内即为异位移植。其易于动态测量瘤块大小、增殖进程，且移植成功率较高。潘泓等[5]研究发现，与皮下移植相比，肾包膜下移植成瘤率较高，但因实验技术更为复杂，对实验动物有较大损伤，且因肾包膜及其脆弱，导致操作容易失败，因此极少应用。除此之外，不可直观测量肿瘤的形态、体积也是肾包膜下移植的显而易见的不足之处。

2.3.1.1 皮下移植瘤模型 在当前的肺癌模型研究中，皮下移植型模型仍是最为多见的。把肺癌组织、细胞注入免疫缺陷动物皮下的方式已经成为以往数十年对恶性肿瘤进行研究的首选途径。皮下移植瘤可在不同部位进行，其可导致肿瘤转移性、成瘤特点等方面产生差异，例如背部、腋部、后肢等，其中以腋部皮下移植最常采用。小鼠肺癌皮下移植瘤是当前检测肿瘤相关药物的重要临床前工具，因为其操作简单、成瘤率高、不影响动物活动且可动态测量等优点。有研究在小鼠不同部位(右腋皮下、右腹股沟皮下、脚垫皮下)分别注入稳定表达萤光素酶的小鼠Lewis肺腺癌细胞，结果显示腋下组肿瘤体积增长稳定，较晚才出现坏死，且肺转移率最高，更适用于实验时间较长、需要观察转移灶的实验。皮下移植造模的方法尽管已较多采纳，同时，也存在不足之处，正因为肺脏与皮下所处内环境存在天壤之别，肺癌细胞一些特性蛋白及因子表达受其原发肿瘤部位差异的影响，表现在局部侵犯、远处定植尤为明显。进行体内实验或药物筛选时，应用皮下移植瘤模型得出的结果与实际临床药效存在极大差异。所以，选取异位造模时，为避免产生药物疗效的假阳性，在抗肿瘤治疗药物研究时，应将某些与药物敏感性有关的特异表达是否可能因肿瘤生长部位差异而不同考虑进去。

2.3.1.2 血管内注射DENG等[6]在雌性裸鼠体内通过尾静脉注入A549单细胞悬液，结果在小鼠体内发现肺部转移瘤，病理显示为肺腺瘤。另外，有研究经裸鼠尾静脉将肿瘤细胞注入裸鼠内，分别于第5、11周观察到肺部转移、恶病质，研究过程无小鼠死亡。

2.3.1.3 左心室注射 为构建脑转移模型，多个研究表明与左心室注射相比，尾静脉注射更易形成肺病灶，而左心室注射更易形成脑转移[7]。曾有研究者大胆猜想，采用左心室内注射的方法能使肺部转移灶出现的几率和数量下降，使脑转移形成率大大提高，其机理可能是因为通过左心室内注射，更多肿瘤细胞可直达脑部形成脑转移灶，而尾静脉注射法中肺部毛细血管网最先捕捉肺癌细胞从而在肺内定植，导致肺部病灶出现。

2.3.2 肺癌原位模型 在动物呼吸系统中接种一定数量的肺癌细胞悬液或瘤块，进而原位成瘤及产生转移灶的建模方法即为肺癌原位模型。与异位皮下接种相比，原位肺癌因其可效仿肺癌临床肿瘤发生机制、远处转移、胸水发生及模拟肿瘤的微环境，在肺癌诊治实验有着重大意义。这个也侧面体现了种子土壤学说，即肺癌细胞的生长、转移具备器官特异性。与此同时，胸膜播散、气胸、血胸是原位移植造模的主要危险。

2.3.2.1 肺脏原位移植模型 肺内移植方法已成为最近几年研究的热门，成为较合适的造瘤模型，因其移植成功率高，而且能最大程度模拟肺癌微环境，与人类肺癌的生物学行为相近。与此同时，原位移植对时间周期长、操作技术要求高、对肿瘤生长的监测难度大。随着科技进步，在经皮穿刺瘤块移植过程中，运用CT引导有动物损伤小、成功率高等优势，因此被广泛应用。

2.3.2.2 支气管原位移植模型HAI等[8]通过气管切开，往右侧支气管用导管注入肿瘤细胞悬液，从而实现原位建模。结果显示，肺癌细胞原位建模能转移到脑、肾、骨骼等全身多个部位。另外，国内有学者在SCID小鼠及裸大鼠一侧肺内通过气管、胸壁穿刺两种方法接种肺癌细胞，从而构建肺癌原位模型[9]。经支气管原位建模，其生理学特性与临床肺癌实际发生发展机理最为接近，应用于肺部肿瘤实验更为恰当。遗憾的是，成瘤数量、大小不稳定、操作难度大、成瘤率较低等缺陷使气管内移植的发展应用受到极大局限。

2.3.2.3 胸腔原位移植模型 胸腔内注射肺癌细胞悬液进行小鼠原位肺癌造模的较高效、简单易行的方式之一。ZHENG等[10]采用胸腔注射法将肿瘤细胞注入裸鼠左肺，应用CT扫描进行动态观察。原位肺癌动物模型的肿瘤形成率为90%，肿瘤转移率为100%。相比而言，胸腔原位种植法建模相对异位皮下肿瘤模型更难以实时动态观察，需要借助CT影像学辅助，而且价格较昂贵。

2.3.2.4 肺内和胸膜同步移植模型 文石兵等[11]将在裸鼠皮下、肺内及肺内和胸膜腔分别注入人肺腺癌细胞，结果显示，与单纯肺内移植组相比，胸水发生率更高，且存活时间更久，而皮下组无胸水、转移灶产生。因此，两部位同步移植法进行造模，可较大程度还原肺部浸润、转移的临床特点，可用于探讨肺癌胸腔积液诊治机理的实验。

2.4 肺癌转移模型

2.4.1 脑转移模型 脑是肺癌较为多见的转移部位之一。脑转移癌动物模型可通过尾静脉、颈内动脉、颅内局部、左心室注射等途径。吴涛等[12]在裸鼠颅内植入人SCLC细胞悬液，造模成功后经病理证实为肿瘤组织。造模成功率高是颅内局部接种的显著优点，但同时也存在不少缺陷，例如难以还原肿瘤形成过程，即无法模拟肺癌细胞的转移过程中随着血液流动形成脑转移病灶等一系列步骤。陈愉生等[13]通过应用胸腔原位及左心室注射法，将PC9细胞注入裸鼠，结果两组脑转移率分别为11.1%、100%，充分证明胸腔原位注射法相比，左心室注射法脑转移率更高。

2.4.2 骨转移模型 肺癌患者，骨转移是肺部肿瘤较为多见的转移位置，转移率为30%～40%。当前而言，应用较多的肺癌骨转移造模有以下几种方法：

2.4.2.1 血管内注射KUCHIMARU等[14]经尾动脉注射和心内注射两种方法，结果显示与心内注射相比，应用尾动脉注射法的肿瘤细胞运输效率为其3倍，且向小鼠下体器官具有显性传递性，而心内注射则导致癌细胞则扩散到各种组织。与心内注射相比，尾动脉注射组的小鼠骨量大大减少。生存期检测显示，心内注射的小鼠注射后在25 d死亡率为100%，而尾动脉注射组小鼠生存期大于32 d。而后，多名学者经尾动脉注射法成功进行了肺癌骨转移造模，且成功率较高，提示该方法是肺癌骨转移造模的可行方法之一。

2.4.2.2 心室内接种DAVID等[15]通过左心室注射法构建A549细胞肺癌模型，使小鼠自发形成骨转移。YANG等[16]通过左心室注射法建立肺癌自发转移的模型，接种一周后给予生理盐水或不同剂量的氟伐他汀干预，结果提示氟伐他汀可以抑制肺腺癌细胞其是骨骼的转移。

2.4.2.3 骨髓腔内注射 在骨髓腔内注射肿瘤细胞即骨内接种：其耗时短、费用低，可用于较长期的研究，且实验期间内不会发生其他脏器组织转移，较适于进行药物实验。但关于其为原发或转移肿瘤的讨论仍无法统一意见。这种方法可效仿肺癌细胞在骨内生长的状况，但其缺陷是难以还原转移经过。SONN等[17]的研究在裸鼠L5椎体骨内注入肺腺癌细胞，病理证实为L5椎体肿瘤侵犯，实现了肺癌单纯性椎体转移建模，在C57BL/6小鼠右后肢胫骨平台下注射肿瘤细胞，然后进行短暂免疫抑制，从而模拟肺癌骨转移过程，结果显示，在制备小鼠肺癌骨转移模型，免疫抑制剂的中、高剂量组成瘤率较高，但相对而言，中等剂量组小鼠有较高的存活率。通过骨内接种建立骨转移模型，操作技术相对易行，但因骨转移率低，少见与此相关的报道。

2.4.3 淋巴道转移 有研究报道，在裸鼠不同部位(左侧背部近腋窝、右侧背部近腋窝、左侧后肢和左后爪垫皮下)注入肿瘤细胞，结果显示左侧背部近腋窝注射成瘤率高，淋巴转移率高，简便易行，为通过皮下造模从而导致淋巴结转移的最优先选择部位[18]。

3 进展

3.1 选择模型物种的创新 兔：相对于鼠而言，兔本身VX2肺癌细胞株具有与人源肺癌极其相似的形态及生理行为，且无自身免疫源性，所以被普遍运用于兔肺癌建模。狗：因为适于在大动物体内生长的瘤株难于找到，因此难进行大动物模型的相关实验。犬传染性性病肿瘤(CTVT)细胞作为新近的动物实验模型研究的热点，其含有稳定、独特的生理特点，可以穿透细胞屏障，躲避体内免疫监视定植从而生长为肿瘤病灶。

3.2 移植性肺癌动物模型制方法改进 微创胸腔穿刺进行肺癌造模简单易行，失败率低，对动物损伤低，但针拔出时肺癌细胞易外溢，致胸腔播散，降低了独立结节形成率，难以评估、监测。最近数年移植方法的改进为减少肿瘤细胞播散带来曙光。

3.2.1 双针共轴瘤块原位移植 有研究报道，在兔体内，CT辅助下运用双针共轴法将肺癌组织接种至兔体内[19]。相比单针移植，双针使胸腔播散率大大下调，而肺孤立结节形成率上升，更有利于实验的检测和评估。肺内孤立VX2成瘤率在该研究组为80%，而在林晓南[20]的报道中，则分别为75%和70%，显而易见共轴穿刺法更胜一筹。

3.2.2 胶原蛋白海绵条 刘宇等[21]用两条可生物降解的胶原海绵条前后包埋瘤块，形成“三文治”结构，再运用胸腔穿刺术植入将其植入兔内，能有效避免瘤块播散导致胸腔种植。

3.2.3 亲水凝胶 李欣等[22]在实验动物体内移植包含瘤块的亲水凝胶，防止肿瘤细胞的播散。并且，其可提高瘤块与实验动物肺上皮细胞的的接触面积，因为凝胶有亲水性，可吸收水分而膨涨。

3.3 高转移细胞株的获取CUI等[23]在裸鼠皮下内接种从中国肺癌患者腹水中提取的肿瘤细胞，1个月后切除原发肿瘤，将其接种至新小鼠皮下，反复传代，并检测各代肿瘤细胞进行转移率，第一、二、三代分别为30%、60%、90%，得到转移效率较高的瘤株，从而后续建模提供保障。

3.4 肺癌组织PDX模型的研究进展 研究报道显示，肺癌细胞在体外反复传代可致一些基因发生篡改，而且，细胞经过消化酶处理后，细胞生理特性会产生变化。亲代肺癌组织的微环境及生理特点可被保存通过PDX模型的建立[24-26]。在免疫缺陷动物体内接种手术或穿刺组织而来的肺部瘤块进行造模即肺癌PDX。新鲜肿瘤组织能立即造模(普遍要求1 h内植入)也可低温保存复苏使用。瘤块大小不等，2 mm3[27]、15～30 mm3[28]均见报道。瘤块混合基质胶再一起接种，若肺癌组织样本量低，则需先混合基质胶进行离心，再植入免疫动物。PDX模型能使肿瘤微环境被最大程度保存。由于PDX模型更贴近人肺癌组织环境，所以越来越受到重视，可能是未来研究肺癌动物模型的方向[29-31]。

4 结语

综上所述，移植性肺癌转移模型是进行肺癌研究的重要支撑，传统的移植性肺癌转移模型主要以皮下移植为主，但是肺脏与皮下所处内环境存在天壤之别，不能精准模拟肺癌的发生发展过程，因此还不能完全满足我们的需要。目前新的移植性动物模型例如PDX模型越来越受研究人员的青睐，因其最大限度的保留亲代肺癌组织的微环境及生理特点，同时相比肺癌原位接种操作相对简单，可能是未来移植性肺癌模型研究方向。