细胞铁死亡在纤维化疾病中的研究进展

曹慧敏,单 云,唐 蕾综述,盛梅笑审校

0 引 言

细胞死亡是多细胞生物维持机体稳态的生物过程。以细胞死亡的功能差异为基准，可将其分为意外细胞死亡(accidental cell death, ACD)和调节性细胞死亡(regulated cell death, RCD)。当机体细胞因偶发的伤害性刺激而失去调节能力导致细胞发生死亡的过程称为ACD。由一个或多个信号通路调控的细胞死亡过程称为RCD，其不仅包含常见的细胞凋亡、细胞坏死、细胞焦亡等形式，还包括新近发现的铁死亡、氧死亡、溶酶体依赖性细胞死亡以及自噬依赖性细胞死亡等细胞死亡形式。在不同的RCD过程细胞生化学、形态学及免疫学发生了特定改变，如细胞凋亡依赖凋亡小体的形成[1]、细胞焦亡则是由炎症小体激活[2]、溶酶体依赖性细胞死亡通过溶酶体破裂触发[3]、自噬依赖性细胞死亡激活自噬分子通路并伴随典型的自噬空泡化改变等[4]。

最新研究发现细胞铁死亡与癌症、神经系统疾病、肺损伤、肾脏损伤等多种疾病的病理密切相关，并且在肺纤维化、肝纤维化、心肌纤维化、腹膜纤维化等多种纤维化疾病进程中发挥着重要作用。多种中药及其有效成分被证实可通过干预细胞铁死亡发挥抗纤维化的作用。以往对纤维化疾病的研究多集中于细胞自噬、细胞凋亡等RCD，因此对细胞铁死亡在纤维化疾病中作用机制的探索，可为抗纤维化的治疗提供新的靶点与方向。

1 铁死亡概述

细胞铁死亡是由铁依赖性的脂质过氧化物(lipid peroxidation, LPO)过量蓄积所触发的RCD。在铁死亡发生过程中，细胞内Fe2+蓄积介导大量活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成，氧化细胞膜上的不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)，损伤细胞膜而导致细胞死亡。细胞铁死亡与其他形式的RCD有着明显差别，在形态学方面，细胞线粒体超微结构发生改变，线粒体嵴减少、线粒体膜凝聚以及线粒体外膜破裂，但不伴随细胞核体积减小，染质凝聚等变化[5]。在生化代谢方面，胞内抗氧化剂谷胱甘肽(glutathione, GSH)不断被消耗，谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)活性降低，氧化-抗氧化平衡状态被打破，ROS不断蓄积，细胞膜发生脂质过氧化后，细胞完整性丧失以致细胞死亡，而该过程可被抗氧化剂和铁螯合剂所抑制[6]。在基因学方面，现已发现调控铁稳态、脂质代谢和氨基酸代谢等途径的相关基因均与铁死亡的生物过程密切相关。随着对细胞铁死亡机制的不断深入，最新的研究还证实了GSH非依赖的铁死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)在豆蔻酰化修饰下负性调控细胞铁死亡以及线粒体二氢乳清酸脱氢酶(dihydroorotate dehydrogenase, DHODH)介导的铁死亡防御机制[7-8]。

2 纤维化疾病中铁死亡相关机制

2.1 铁代谢失衡通过增加铁的吸收、减少铁的储存和限制铁的外流会导致细胞内铁蓄积，引起细胞内铁稳态失衡，触发信号级联反应诱导铁死亡。生理状态下，转铁蛋白(transferrin, TRF)识别转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1, TFR1)后介导Fe2+摄取，铁蛋白轻链(ferritin light chain, FTL)和铁蛋白重链1(ferritin heavy chain, FTH1)组成铁蛋白后与Fe2+结合形成储存铁，而FTH1/FTL通过自噬降解，增加了细胞内Fe2+水平。同时细胞膜上的溶质家族蛋白(solute carrie, SLC)40A1介导的Fe2+外流及外泌体参与的铁蛋白输出可抑制细胞铁死亡。研究发现，沉默TFRC基因或过表达热休克蛋白β-1(heat shock prtein β-1, HSP β-1)均可减少TFR1的合成，影响Fe2+的摄入，从而抑制细胞铁死亡[9]。通过抑制铁反应元件结合蛋白2(iron responsive element binding protein 2, IREBP2)的表达可显著上调FTL和FTH1，稳定细胞内Fe2+水平，从而抑制铁死亡激动剂erastin所诱导的细胞铁死亡[10]。

另有研究显示，铁代谢失衡和过量铁蓄积可促进组织纤维化的发生。Yang等[11]观察到发生纤维化的小鼠肾脏中Fe2+显著增加，而细胞铁死亡关键靶点GPX4、TRF及SLC7A11蛋白表达减少，提示肾脏细胞铁死亡可能是加重肾脏纤维化的因素。TRF缺乏症是一种常染色体隐性遗传的代谢性疾病，具有TRF低表达，伴随重度贫血、肝脏铁过载和纤维化等表征。Yu等[12]观察发现高铁饮食的小鼠表现出体内多脏器铁蓄积，并伴随肝损伤及肝脏纤维化；而在TRF基因敲除小鼠和肝细胞特异性TRF、SLC39A14双基因敲除小鼠中，采用高铁饮食或四氯化碳注射干预，进一步明确了SLC39A14基因参与细胞内Fe2+的转运，表明肝脏TRF缺乏可引起细胞铁死亡诱发肝脏纤维化。在过量铁剂诱导的心肌纤维化的巴马小型猪模型中，铁沉积量和心肌纤维化程度呈正相关[13]。因此，去铁治疗有助于延缓及改善组织纤维化。

铁自噬的激活可通过影响铁代谢来调控细胞铁死亡。肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)的活化是肝纤维化发生的关键环节。Zhang等[14]发现在铁死亡激动剂索拉非尼和erastin靶向诱导的HSC铁死亡中，RNA结合蛋白胚胎致死性异常视觉样蛋白1(embryonic lethal abnormal vision like 1/human antigen R, ELAVL 1/ HuR)的上调可通过稳定自噬相关蛋白Beclin-1的表达，促进TRF降解而释放Fe2+，引起铁代谢失衡，进而诱导HSC发生铁死亡。此外，ELAVL 1/ HuR的上调还增强了HSC对索拉非尼的敏感性，促进HSC发生铁死亡，改善小鼠肝纤维化。

2.2脂质过氧化异常发生氧化、脂化的PUFA是导致细胞铁死亡的直接原因。PUFA在ROS的氧化作用下生成毒性LPO，破坏脂质双分子层的完整，最终影响细胞膜的功能。PUFA脂化后形成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines, PE)，PE又是细胞铁死亡氧化过程中的主要底物。活化的酰基辅酶a合成酶长链家族成员4(acyl-coa synthetase long-chain family member 4, ACSL4)参与PE的生物合成和重塑，而溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶3(lyso phosphatidyl choline acyl transferase 3, LPCAT3)进步一协助PE嵌入细胞膜磷脂中，进而影响膜功能。因此，抑制ACSL4和LPCAT3的表达，可降低细胞内LPO底物的累积，从而减少铁死亡的发生。

细胞内脂质过氧化异常和组织纤维化的发生发展密切相关。Fe2+的芬顿反应伴随ROS的生成，铁代谢直接影响细胞内ROS和LPO水平。在铁死亡激动剂erastin和RSL3诱导的铁死亡过程中，均伴有ROS的蓄积；而应用特异性铁死亡抑制剂(如：ferrostatin-1, Fer-1、liproxstatin-1, Lip-1)可减少erastin诱导的ROS累积，表明ROS蓄积促进了细胞铁死亡的发生[5]。转化生长因子(transforming growth factor, TGF)是各种组织纤维化的关键调节因子。研究发现肺纤维的患者血清中TGF-β表达上调，而ROS蓄积可加重TGF-β1诱导的肺纤维化[15-16]。TGF-β1干预人肺成纤维细胞使得α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)、I型胶原蛋白(collagen Ⅰ, COL1)表达升高，电镜下细胞线粒体呈现典型的铁死亡特征；而Fer-1可逆转TGF-β1诱导的ROS、MDA、α-SMA、COL1升高和GPX4的下调[17]。铁死亡抑制剂Lip-1则可通过激活核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)途径，下调TGF-β1从而减轻肺纤维化[18]。SLC38A1是脂质过氧化中谷氨酸摄取和代谢的调节因子[19]。Yang等[20]发现IncRNA ZFAS1可通过miR-150-5p调控SLC38A1的表达，激活肺组织中成纤维细胞转化为肌成纤维细胞并伴有细胞铁死亡发生。此外，p62-Keap1-Nrf2途径涉及肺泡上皮细胞内Fe2+代谢和ROS生成过程，调控细胞铁死亡和细胞损伤程度，影响肝纤维化的进程[21]。

2.3GPX4活化抗氧化酶GPX4是GPXs家族的一员，也是调控铁死亡的关键靶点之一。GPX4能特异性还原氢过氧化的磷脂和脂肪酸(fatty acid, FA)，从而保护机体免受LPO介导的氧化应激的损伤，直接或间接抑制GPX4活性均可致细胞膜LPO积累而诱导细胞铁死亡。GSH是GPX4发挥解毒作用的还原辅助因子，GSH的摄入或合成途径受阻，会直接影响GPX4的脂膜修复能力；抑制甲羟戊酸途径影响GPX4活性基团硒代半胱氨酸(selenocysteine, Sec)合成，同样导致GPX4的活性下调。此外，GPX4还是RSL3、DP17、DP110、DP112等多种铁死亡激动剂的直接作用靶点，而过表达GPX4的细胞系会对铁死亡激动剂的敏感性降低[17]。

已有研究证实，提高GPX4的活性可延缓组织纤维化的进程。在纤维化疾病的组织中可以检测到铁死亡的生物标志物ROS、丙二醇(malondialdehyde, MDA)和GPX4的表达增多[22]。有研究发现TGF-β1具有类似于erastin的作用，可诱导肺成纤维细胞线粒体膜皱缩甚至破裂，而Fer-1可下调TGF-β1引起的ROS、MDA升高，恢复GPX4活性并下调纤维化标志物的表达[23]，过表达GPX4可减轻TGF-β1诱导的肺成纤维细胞氧化应激反应，抑制细胞铁死亡并可逆转肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化(fibroblast-myofibroblast transition, FMT)[16]。此外，GPX4的缺乏可诱发炎症反应发生，它被证明能够调节二十烷类生物合成和核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)信号传导[24]；在人胚胎肾细胞293(HEK293)中，GPX4激活剂还被证明可以防止肿瘤因子(tumor necrosis factor, TNF)介导的NF-κB激活[25]；GPX4又可抑制NF-κB靶向的真皮成纤维细胞中的基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1)的表达[26]。以上研究表明GPX4/NF-κB通路可能有助于控制纤维化进程。

2.4System xc-体系胱氨酸/谷氨酸转运系统(system xc-, xc-)是位于细胞膜上重要的抗氧化体系，该系统由轻链SLC7A11和重链SLC3A2两个亚基组成。SLC7A11负责转入胱氨酸用于GSH的合成，而伴侣蛋白SLC3A2则维持SLC7A11的稳定性和膜定位。System xc-的活性降低会影响胞内胱氨酸的吸收，致使胞内GSH不断被耗竭，GPX4的活性降低，从而导致细胞铁死亡。氧化应激条件下，活化转录因子(activating transcription factor, ATF)4[27]和Nrf2[28]正向调控SLC7A11的表达，而肿瘤抑制因子P53和ATF3[29]则被证实抑制SLC7A11的转录。有趣的是，研究者发现卵巢肿瘤相关蛋白酶B1(domain-containing ubiquitin aldehyde-binding protein B1, OTUB1)可阻止SLC7A11的泛素化而维持SLC7A11蛋白的稳定[30]，而雷帕霉素靶蛋白复合物1(mammalian target of rapamycin 1, mTORC1)又可激活溶酶体加速SLC7A11蛋白降解[31]，以上途径均可影响system xc-的转运功能，进而调控细胞铁死亡。

越来越多的证据表明SCL7A11参与调控肝纤维化。阻抑HSC的活化、增殖是预防和治疗肝纤维化关键环节。Du等[32]发现SLC7A11的低表达，可阻抑肝星状细胞向肌成纤维细胞转分化进程(myofibroblasts-hepatic stellate cells transdifferentiation, MF-HSC)，并影响细胞内GSH的合成，诱导HSC发生铁死亡，从而减轻肝纤维化。Zhu等[33]研究发现过表达三结构域蛋白26(tripartite motif 26, TRIM)可促进SLC7A11泛素化进而加速此蛋白降解，致HSC中LPO增多，诱导HSC发生铁死亡从而缓解四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化。因此，靶向下调SLC7A11诱导HSC铁死亡可能成为治疗肝纤维化的新途径。

3 中医药通过干预细胞铁死亡发挥作用

中药可通过抑制细胞铁死亡而发挥抗纤维化的作用。天然铁死亡抑制剂黄芩素可预防氧化应激引起的损伤，阻抑erastin和RSL3诱导的细胞铁死亡[34]。槲皮素被证实是一种有效的铁死亡抑制剂，它既可以促进ROS和LPO在细胞内的代谢，又能够稳定细胞内Fe2+水平，从而减少铁超载引起的组织损伤[35]。以红参、黄芪、淫羊藿、葶苈子等为组分的中药复方通过抑制JNK/P53信号通路，靶向SLC7A11/GPX4/GSH信号轴，减少ROS生成，抑制细胞铁死亡，改善小鼠心脏功能，减轻肾脏纤维化[36]。研究发现中成药心阳片可通过抑制MLK3/JNK/P53通路，上调细胞内SLC7A11和GPX4的水平，提高心肌细胞抗氧化能力，进而抑制细胞铁死亡，改善心功能及心肌纤维化[37]。

另一方面，一些中药及其活性成分被证实通过促进细胞铁死亡而拮抗纤维化。青蒿素和胡椒是细胞铁死亡的诱导剂，主要通过增加细胞中ROS水平、影响GSH合成、干扰铁代谢途径和增加Fe2+浓度来诱导铁死亡[38-39]。Sui等[40]发现异甘草酸镁可通过诱导HSC发生铁死亡而减轻肝损伤和肝纤维化瘢痕形成，其作用机制是通过上调HSC中血红素氧化酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)，抑制其下游靶基因TF、TFR1和FTH1，促进铁富集并诱导细胞铁死亡；Wang等[41]发现蒿甲醚能上调P53而抑制SLC7A11，促进HCS铁死亡，使肝纤维化标志基因表达明显降低；青蒿琥酯也被证实能依赖铁自噬的激活诱导HSC铁死亡，发挥抗肝纤维化的作用[42]。与传统的铁死亡诱导剂和抑制剂相比，对铁死亡有调控作用的中药及其活性成分具有多靶点调控和结构稳定的优势。然而，仍需要进一步深入的机制研究来支持目前结论。

4 结 语

大量研究证实了细胞铁死亡可调节炎症损伤、信号转导和细胞生长，从而影响纤维化疾病的病理进程，但对细胞铁死亡在纤维化疾病中的机制研究仍处于初始阶段。尽管目前尚无靶向细胞铁死亡的药物投入临床使用，但有研究表明一些广泛应用于临床的药物可通过干预细胞铁死亡发挥疾病治疗作用。此外，多种中药及其有效成分可通过干预细胞铁死亡发挥抗纤维化的作用。因此，对铁死亡机制的探讨有望为纤维化疾病的防治提供新的靶点和方向。