军团菌致病性检测方法研究进展

王艳晴，任红宇，赵 娜，陈海婴，刘明斌1,，秦 天

(1.南昌大学公共卫生学院，江西省预防医学重点实验室，南昌 330006； 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所呼吸道传染病室，传染病预防控制所国家重点实验室，北京 102206； 3.南昌市疾病预防控制中心，南昌 330038)

军团菌病(Legionnaires’ disease，LD)于1976年在费城的一次军事集会上首次大规模暴发，并导致34人死亡[1]。此后，在社区、医院和旅行相关中出现了军团菌病的暴发或零星传播[2]。军团菌是兼性胞内革兰阴性杆菌，广泛存在于水、土壤、人工水系统等环境中，且以在人工水环境居多[3]。军团菌主要存在于冷水中，但近年来热水系统分离出军团菌也常有报道[4]。嗜肺军团菌(legionella pneumophila,LP)，是引起军团菌病的主要军团菌种，对环境中军团菌监测并有效检测其致病能力强弱对保障公众健康、减少损失具有重要意义。

1 军团菌的致病机制

军团菌能够在多种吞噬宿主中复制，包括许多变形虫物种到哺乳动物细胞，形成一个独特的膜结合复制生态位，称为含军团菌液泡(Legionella-containing vacuole，LCV)[5]。这种复杂的细胞内隔室使军团菌能够逃避吞噬体的降解、躲避细胞内防御并截获营养物质以支持复制。为了做到这些，军团菌采用不同的分泌系统，通过一个或两个细胞膜将毒力相关蛋白传递到作用部位。而2型分泌系统(PilD-dependent Lsp型)和4B型分泌系统(Dot/Icm型)由所有军团菌菌株编码，1型分泌系统(Lss型)仅限于嗜肺军团菌，4A型分泌系统(Lvh型)随机分布在不同物种之间[6]。各型分泌系统代表军团菌的关键毒力并在嗜肺军团菌的生态和发病机制中起关键作用[7]。

2 军团菌致病性检测方法

2.1 分子生物学方法

2.1.1 聚合酶链式反应

嗜肺军团菌中存在多种毒力基因，包括mip(macrophage infectivity potentiator)、ira(iron acquisition and assimilation)、lvr(Legionella virregion)、ot(defective organelle trafficking gene)、icm(intracellular multiplication gene)、lvh(legionella vir homologues)、cpx(conjugative pilus expression)、rtxA(repeats in structural toxin)。Mip编码蛋白可以抵抗针对哺乳动物和原生动物吞噬细胞的细胞内杀伤[8]；cpxRA调控ⅣB型分泌系统分泌效应蛋白必不可少的因素[9]；iraA基因座编码的甲基转移酶是细菌胞内感染所必需的；iraB基因座编码的假设铁-肽转运蛋白可利用铁负载肽的方法参与菌体对高价铁的摄取[10]；lvr基因负责调控lvh家族分泌蛋白[11]；rtxA编码与黏附、细胞毒性和孔隙形成相关的蛋白质。Lvh编码ⅣA型分泌系统衍生蛋白质，有助于结合毒力[12]；dot/icm编码ⅣB型分泌系统衍生蛋白质,负责军团菌在宿主细胞内复制[13]。毒力基因是DNA的不同区域，存在于致病菌的基因组中，在相同或相关的非致病性菌株中不存在。军团菌的致病性与毒力密切相关，根据病原体毒力基因扩增结果，判定其致病性大小[14]。聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种用于放大扩增目标核苷酸序列的分子生物学技术，2～3 h就能将待扩增目的基因扩增几百万倍。反应结束后，将扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分离，结果为阳性，即确定该基因的存在。模版核酸提取质量不高，会出现假阴性结果[15]，但该方法特异性强、灵敏度高,是其他分子生物学实验的基础。军团菌毒力PCR检测只能在有限数量的实验室使用，实验室使用各种内部分析方法[16]。HWANG等[17]成功研究出针对dot/icm、lvh和rtxA3个毒力位点的PCR方法；ZHAN等[18]使用47株参考菌株、235株环境株和4株临床株并使用针对iraA、iraB、lvrA、lvrB、lvhD、cpxR、cpxA、dotA、icmC和icmD,研究结果说明了毒力基因与军团菌致病性的关联。

2.1.2 多位点可变数串联重复分析检测毒力基因型

多位点可变数目串联重复序列分析(multiple Locus Variable-number tandem repeat analysis,MLVA)是一个基于PCR技术的分型方法，该方法通过区分基因组上多个具有多态性串联重复序列位点的重复数来区分菌株。此方法分辨率高、重复性好、快速，结果可用于不同实验比较。有报道[19]表明，由MLVA-8(使用8个基因座的多基因座可变数目串联重复分析)分析表明特定基因型与毒力有关。SHARABY等[20]确定不同的MLVA-8基因型对61例环境和12例临床嗜肺军团菌分析，得出Gt4菌株对巨噬细胞显示出更高的细胞毒性，并将Gt4菌株视为评估军团菌在饮用水中公共健康风险的主要因素。SHARABY等[21]对93株嗜肺军团菌环境株和12株临床株使用MLVA-8基因分型分析其对常用10种抗菌药物的敏感性，发现Gt4菌株的耐药性更强。

2.1.3 微型DNA微阵列检测军团菌毒力基因

DNA微阵列由成千上万的DNA序列组成，每一个都代表一个特定的基因以网格方式贴在玻璃显微镜载玻片上，运用互补核酸杂交的原理，荧光素标记的核酸样品与阵列互补DNA序列杂交，用激光共聚焦显微镜测量固定化靶DNA的荧光强度，用特定波长的激发和发射滤光片获得荧光图像，同时监测成千上万个基因的功能，与普通PCR相比成本更低，耗时更少，且样品不易受到污染，缺点是仅局限于预设好的目标基因的检测，覆盖范围较少。ZAK等[22]运用此技术开发出一种微型DNA芯片，用于鉴定军团菌的66个毒力基因，确定菌株的毒力潜力有助于选择最有效的干预措施。

2.1.4 利用遗传标记物鉴别军团菌临床与环境株

DEN BOER等[23]利用军团菌菌株的微阵列数据，使用随机森林算法与逻辑回归相结合分析，该模型得出4种DNA标记物区分临床和环境菌株。它们可以正确预测荷兰国家军团菌爆发检测计划中收集到的96%的临床菌株和66%的环境菌株。

2.1.5 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测军团菌的特异基因

基质辅助激光解吸电离(matrix-assisted laser desorption ionization，MALDI)技术和飞行时间质谱(time of flight mass spectrometry，TOF-MS)是通过激光照射使样品分子电离，从固相标本中产生离子，并在飞行管中测其分子量。通过分析菌株的核糖体蛋白，在物种水平上鉴定微生物，构成了一种易于使用、快速、准确和经济高效的菌种鉴定方法。最近，KYRITSI等[24]用此技术确定军团菌lvh和rtxA基因座特异性峰值生物标志物，得出3个峰值作为lvh和rtxA基因座的潜在生物标志物：lvh的峰高为3 712 109 Da，检测的灵敏度为82.5%，特异度为100.0%，准确率为84.1%；rtxA峰高为2 653.232 Da和3 598.706 Da，显示100.0%的灵敏度、76.5%的特异度，准确率为97.4%，结果显示MALDI-TOF-MS对2个毒力基因检测的良好分辨力。

2.2 基于免疫学的检测方法

2.2.1 酶联免疫吸附

酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)是一种用于检测和定量附着于固体表面的抗体或抗原的简单快速的技术。添加酶的底物产生与原始样品中存在的抗原量相关的颜色变化或光信号，根据颜色深浅或化学信号强弱和样本中的抗原量呈正比的关系，计算出样本中的抗原总量或浓度。此种方法操作简单、灵敏度高；但对技术人员操作要求高，因为使用的是重组抗原，特异度不高容易产生假阳性结果。嗜肺军团菌的发病机制的关键特征是嗜中性粒细胞迅速流入肺，IL-1α是嗜中性粒细胞募集到嗜肺军团菌感染小鼠肺部的关键引发剂。BARRY等[25]利用此技术检测被嗜肺军团菌感染的小鼠释放的IL-1α的量，发现嗜中性粒细胞募集是对强毒嗜肺军团菌的反应，确定IL-1α的释放量与菌株毒力呈正相关。

2.2.2 蛋白质印记

免疫印迹(immunoblotting)即蛋白质印迹(western blotting)，是根据抗原抗体的特异性结合蛋白的方法。将混合抗原样品在凝胶板上进行单向或双向电泳分离,在印迹纸的自然吸附力或其他外力作用下,使凝胶中抗原组份转移到印迹纸上,然后将固定化基质膜与凝胶相贴。经底物显色和放射自显影经底物显色以及放射自显影对抗原固定化基质膜进行检测和分析。免疫印迹的分析操作简单，省时、省力，可同时鉴定多种蛋白。鞭毛及其分泌的蛋白有助于嗜肺军团菌的运动、寻找宿主、生物膜定植和毒力[26]。CHEN等[27]利用此技术鉴定PAL、PilE、FlaA蛋白和PAL/PilE/FlaA融合蛋白在293细胞中的表达，成功开发了一种重组肽聚糖相关脂蛋白(PAL)/IV型菌毛蛋白(PilE)/flagellin(FlaA)DNA疫苗。

2.2.3 双荧光素酶报告基因检测

双荧光素酶报告基因检测(dual-luciferase reporter assay，DR)是检测转录因子和其靶启动子中的特异性结合的重要手段。将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染至相关的细胞系，加入荧光素酶底物产生荧光，如果转录因子激活靶启动子则荧光素酶基因表达，通过检测荧光强度判断转录因子与靶启动子片段的结合作用。NF-κB蛋白是转录因子家族，NF-κB通过控制大量基因的表达，在哺乳动物的天然免疫应答、炎症反应、细胞生长和存活以及增殖中至关重要[28]。NF-κB蛋白由5个不同的相关家族成员组成，RelA、RelB和RelC用于调节基因表达；前体蛋白p100和p105抑制DNA结合。传统的NF-κB途径主要通过促炎性受体(如TNF受体超家族、Toll-Like受体家族)和白介素的细胞因子受体的激活而被激活。WANG等[29]研究不同嗜肺军团菌在小鼠模型中的毒力与其在体外激活NF-κB信号通路的能力之间的关系,将NF-κB报告质粒转染HEK 293T细胞，再用嗜肺军团菌感染HEK293T细胞，使用Promega公司的双荧光素酶报告系统试剂盒分析不同菌株激活NF-κB 的能力，激活NF-κB能力强的嗜肺军团菌诱导A/J小鼠血清和肺组织细胞因子与趋化因子检出率更高，小鼠死亡率更高，由此得出军团菌体外诱导NF-κB的能力与其毒力成正相关。

2.3 LDH细胞毒性检测试验

乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)是一种稳定的蛋白质，存在于正常细胞的细胞质中。当细胞膜被破坏，LDH就会被释放到细胞外。LDH细胞毒性与其引起的动物死亡率及人体死亡的血药浓度之间都存在良好的相关性，病原体对人体的损伤和死亡，最终可表现为细胞水平上的改变。LDH细胞毒性检测有商品化试剂盒，根据500 nm酶标仪检测细胞上清中LDH的活性，判断细胞受损的程度。KORIYAMA等[30]也利用此方法对军团菌的毒性进行了检测，并确定MOI(multiplicity of infection)<10时，宿主细胞的损伤程度较低；LDH含量也是区别军团菌肺炎与其他社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia，CAP)的指标之一[31]。此分析方法灵敏、操作简单、结果准确；但细胞毒性的评估是基于细胞损伤来定量的，所以要确定最佳细胞用量。

2.4 表面增强拉曼光谱法快速鉴定军团菌毒力

拉曼光谱(Raman spectroscopy，RS)属于分子振动光谱,不同的波段对应于不同官能团的振动频率，根据分子的化学键及其特定的振动频率，每个分子都有一个独特的光谱，称之为“指纹”，因此，拉曼光谱能提供分析物分子的丰富信息。拉曼光谱技术提供了无标记和非破坏性评估人体中细胞和组织功能的能力。然而，传统拉曼光谱技术存在信号强度低、荧光干扰强等缺点，应用比较受限。据ZHAO等[32]报道吸附在粗糙化处理的银表面上的吡啶分子产生的拉曼光谱信号将比溶液中同数量吡啶的拉曼信号增强，最高可达到1014数量级。这种增强效应与特殊介质的粗糙表面相关，其对应的光谱技术称为表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)技术。常用的介质包括银、金、铜等。在不使用样本标签的情况下，研究人员能够在30 min内获得准确的检测结果[33]。SERS的应用在很大程度上提高了病原体检测的灵敏度和特异度，大大缩短了检测所需的时间[34]。与传统的拉曼光谱技术相比，SERS光谱带窄，光谱峰分辨率高，因此有效减少了荧光背景干扰[35]。LI等[36]采用532 nm激光对军团菌产生的拉曼光谱进行分析：最大峰高差异>4000，代表被测军团菌的毒力因子水平高，具有较强致病性；相对应的，最大峰差异<2000，则代表被测样品致病性弱。

2.5 细胞模型检测军团菌致病性

军团菌广泛存在于天然和人造水系统中。被军团菌污染的水在空气中以气溶胶的形式存在，通过呼吸道被吸入人体，它主要感染巨噬细胞和肺上皮细胞，并在其中繁殖，导致可能致命的社区或医院获得性肺炎。有许多关于嗜肺军团菌的细胞侵袭和胞内增殖的报道[37-39]，包括原生动物、人支气管上皮样细胞系(16HBE、BEAS-2B)、吞噬细胞(包括人巨噬细胞样细胞系(U937、THP-1、HL60、MM6)、鼠类巨噬细胞样细胞系(J774.1，Raw264.7))、人肺癌细胞系(A549)、中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)、乳腺癌细胞系(MCF-7和MDA-MB-231)等被用于研究军团菌进入细胞并在细胞内生存、繁殖的过程；军团菌有毒株能够在细胞内繁殖并将它们杀死，而无毒株既不能在其中繁殖也不能杀死细胞。嗜肺军团菌与特定宿主细胞之间的相互作用具有一些独征，细胞侵袭机制和细胞内生活方式在一些细胞系中已被描述[40]。军团菌对巨噬细胞样细胞系的黏附和侵袭能力高于非吞噬细胞系,在不同细胞系的增殖能力相似；THP-1人巨噬细胞样单核细胞系和A.阿米巴被广泛用作研究军团菌的毒力的细胞模型[41]。有研究[42]表明，使用非吞噬宿主模型(例如HeLa和L929)可以使细菌内化。QIN等[1]使用J774细胞模型研究基于最小核心基因组(MCG)分组各组的致病性，成功得出在9个MCG组中，8个显示出高的细胞内生长能力，而1个显示出低的细胞内生长能力，从而表明MCG分组在军团菌致病性研究也有重要意义。细胞毒性的传统测量方法依赖于终点分析，CHIARAVIGLIO等[43]开发了一种高通量实时测定法，以同时鉴定靶向细胞内细菌病原体的真核细胞渗透性抗菌剂和评估真核细胞的细胞毒性。

2.6 动物模型检测军团菌致病性

有效的免疫反应对人类感染的结果至关重要。动物模型在细菌发病机制和宿主反应的体内研究为发病机制提供了有用的手段，依据模型的体重变化、LD50、组织病理变化以及血清细胞因子的水平来初步评估病原体的致病性。豚鼠模型对嗜肺军团菌极为敏感，因此为实验性嗜肺军团菌感染提供了一个有用的模型。然而，使用豚鼠进行的免疫学研究受到豚鼠特异性试剂可用性的限制。相比之下，小鼠特异性免疫试剂种类繁多，加上繁殖时间短、平均体积小，使得小鼠成为体内实验性嗜肺军团菌感染的非常有吸引力的候选者。A/J小鼠由于lgn1位点突变而对军团菌易感，因此它提供了军团菌肺部感染的早期小鼠模型[44]。而C57BL/6的巨噬细胞几乎不允许复制。A/J背景的小鼠不是最合适的模型，因为绝大多数可用于生物学研究的敲除小鼠是在C57BL/6或129背景中发现的[45]。但出于伦理和经济方面的考虑，阻碍了它们在军团菌分离物或小分子抑制剂的高通量筛选研究中的应用；大蜡螟幼虫可从商业供应商处大量获得，无需专门设备即可进行维护，并可通过注射感染，可用于快速评估军团分离株的毒力，但缺乏哺乳动物免疫系统的复杂性。

3 总结与展望

目前PCR方法已经成为实验室以及临床军团菌毒力分析的主要方法，其特异性强、灵敏度高的特点也使其成为其他分子生物实验的重要基础；MLVA就是基于PCR方法发展而来的高分辨率、可重复、快速的检测方法；DNA微阵列成本低耗时短，但其覆盖范围少，可用于特定性毒力基因的快速检测；遗传标记物与MALDI-TOF-MS是实验室的创新检测方法；免疫学法影响因素少，可重复性高，但灵敏度相对不高，难免会出现假阳性结果；SERS是根据分子化学键的频率分析物质的毒力特性，灵敏度、特异性高，检测时间短。然而，毒力基因的存在不一定能真实反映毒力功能的高低，需要进一步的分子生物学功能实验来确认。细胞实验与动物实验分别是在细胞与生物层面对军团菌的毒力进行检测，虽然耗时长，但其是最准确的致病性评价方式。随着社会与医疗科技的发展，在面对公共卫生事件、实验室检测诊断等方面对细菌毒力检测的需求也有新的需求。对环境中军团菌的致病性强弱评估可为军团菌风险定量评估提供有价值的参数。