C型利钠肽对卵母细胞减数分裂阻滞的影响

孙一丹，刘清扬

(西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100)

0 引言

迄今为止，人们在哺乳动物体内发现三种利钠肽，包括心房利钠肽(atrail natriuretic peptide，ANP)、脑利钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)及C型利钠肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。由利钠肽及其受体构成的3个内源型配体系统称之为利钠肽家族。其中，ANP和BNP主要来源于心房和心室，在血管扩张、调节体内血压、水及电解质平衡以维持机体内环境稳定等方面发挥重要作用。CNP是由血管内皮细胞合成一种新型的血管活动调节肽，主要分布于中枢神经系统，具有维持心血管系统稳定、调节细胞生长及激素水平的作用。近年来人们发现，CNP在动物生殖过程亦发挥着重要作用，CNP调控雌性哺乳动物卵母细胞第一次减数分裂的停滞和恢复功能，现已广泛应用于卵母细胞体外成熟(IVM)的技术体系。CNP能够维持哺乳动物性成熟前卵母细胞减数分裂的阻滞，克服体外培养成熟的卵母细胞中细胞核和细胞质成熟不同步的挑战，从而提高体外培养卵母细胞的成熟率和后续胚胎的发育。研究发现，在CNP或NPR2突变小鼠中出现卵母细胞的减数分裂过早恢复，证明CNP在维持雌性动物卵母细胞减数分裂过程中发挥关键作用。本文主要对CNP及其受体结构、CNP对卵母细胞成熟的影响及其调控机制、CNP在老龄雌性动物IVM的应用等进行总结，旨在探究CNP改善老龄动物卵母细胞成熟和受精能力的有效方法，为提高珍稀物种生育力的保存和高龄产妇人工辅助生殖提供理论支持。

1 C型利钠肽

1.1 C型利钠肽结构

C型利钠肽是由Tetsuji Sudoh于1990年首次在猪脑提取物中发现的一个由22个氨基酸残基组成的多肽，广泛存在于动物神经系统、内分泌系统、循环系统及生殖系统中[1]，在保持心血管系统功能稳定、调控细胞增殖及促进骨骼生长方面发挥着重要作用[2]。过去的研究集中表明，CNP作为利钠肽家族的第3个成员，其氨基酸序列及药理学光谱与ANP、BNP具有明显的相似性[3]；它们共有的核心结构是通过二硫键连接形成的由17个氨基酸残基构成的环状结构[4]，该结构对CNP能够刺激大鼠血管内皮细胞产生cGMP有重要作用并对维持CNP生物活性具有重要意义[2]。

与ANP、BNP不同的是，CNP终止于第2个半胱氨酸残基，缺乏羧基末端延伸[5]。现阶段，多篇研究均表明CNP的氨基酸序列在不同物种中，如人、猪、小鼠等，具有高度保守性[6]。体内CNP主要以CNP-22及CNP-53 2种形式存在。由126个氨基酸组成的CNP原经剪切后产生由其氨基端23个氨基酸构成的信号肽和由其羧基端53个氨基酸组成的具有生物功能的多肽(CNP-53)，而CNP-53又可被细胞外酶分解为羧基端22个氨基酸组成的CNP-22[7]。CNP-22是其发挥生物学作用的主要形式[4]。此外，现有研究表明CNP预处理在哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞及后续发育能力影响具有重要意义，CNP可作为生理性减数分裂抑制剂，通过与其特异性受体结合发挥生理学作用，来维持卵母细胞减数分裂阻滞。

1.2 C型利钠肽受体结构

目前，已经研究发现4种利钠肽受体(Natriureticpeptidereceptor，NPR)，包括NPR1、NPR2、NPR3及新发现的NPR4，其中，CNP对NPR2的亲和力明显强于与NPR1及NPR3的亲和力[4]。NPR2为鸟苷酸环化酶(Guanylyl cyclase，GC)偶联受体，其配体结合区由大约450个氨基酸组成，其中Glu332对CNP结合特异性具有重要意义；其唯一的跨膜区域由20～25个氨基酸序列组成；胞内结构包括激酶同型区域(kinasehomologydomai，KHD)、卷曲螺旋状的二聚体及鸟苷酸环化酶催化区域3个部分[6]。

1.3 C型利钠肽信号传导通路

CNP可与卵丘细胞中的NPR2受体特异性结合，使受体的 KHD构象发生变化[2]，激活鸟苷酸环化酶，促使卵丘细胞产生环鸟苷酸磷酸(Cyclic guanosine monophosphatec，cGMP)，上调cGMP浓度，cGMP通过缝隙连接进入卵母细胞后抑制磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)的活性来维持卵母细胞内高水平的cAMP，从而来维持卵母细胞减数分裂的阻滞直至排卵。

2 卵母细胞成熟及其调控机制

2.1 卵母细胞成熟

卵母细胞成熟包括细胞核成熟和细胞质成熟2个过程，二者均对受精过程及受精卵的成熟起着至关重要的作用。卵母细胞质成熟的同时，卵母细胞核也经历着成熟的过程。卵母细胞胞质的成熟晚于核成熟，主要由于细胞核成熟时，胞质发育所需必要的因子还未完全成熟。卵母细胞核成熟的标志，通常是生发泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)和第一极体的排出[8]。停滞于第一次减数分裂的卵母细胞，核呈泡状，染色质十分松散，又名生发泡(germinal vesicle，GV)，当其恢复减数分裂后，则不再形成rRNA，核膜破裂，核仁消散，细胞核更加致密，此过程称为生发泡破裂(GVBD)，随后第一极体排出[8]。卵母细胞进入第二次减数分裂期且停滞在M Ⅱ期，即此时卵母细胞细胞核完全成熟。

卵母细胞质成熟的指标较多，包括线粒体、皮质颗粒的变化情况和GSH。未成熟卵子的线粒体在胞质中多呈周边分布，线粒体簇不大，在细胞逐渐成熟的阶段中，线粒体从胞质皮质部迁移至胞质内部，数量增多[9]。在卵母细胞体外成熟(IVM)过程中，线粒体着色加深，簇变大，在发育潜力较差的卵子中，仍呈周边分布，而在发育能力良好的卵子中，则呈均匀分布[10]。胞质成熟的重要标志是线粒体重新分布与皮质颗粒(cortical granules，CGs)分布。当观察到CGs位于卵母细胞的细胞质中或在皮质的中部或由中部向边缘迁移，则胞质没有成熟或即将成熟，若位于皮质下则说明细胞质成熟[11]。研究表明，多种物质能依靠提高谷胱甘肽(GSH)在细胞中的表达水平，来达到增强胚胎发育能力的目的。所以，谷胱甘肽同样可视为卵母细胞质成熟的关键因素之一[12]。

2.2 卵母细胞成熟调控机制

卵母细胞从胎儿期至青春期一直阻滞在第一次减数分裂前期。物种不同，则卵母细胞阻滞时间也不相同，且多种细胞因子共同调控，才使少部分初级卵母细胞恢复减数分裂。卵母细胞长期阻滞于第一次减数分裂前期的双线期，是由细胞内信使分子——环磷酸腺苷(cAMP)升高导致。目前人们普遍认可，有两条途径可使cAMP升高：一是通过自身活化的 GPR3-Gs-ADCY 级联反应生成环磷酸腺苷，使卵母细胞内cAMP水平升高；二是存在某种物质能够水解环磷酸腺苷，如PED3。蔡姣等[13]研究发现，作为组成MPF的亚基，Cyclin B的降解与CDK1的磷酸化均可降低MPF的活性，这也有助于在LH 峰的出现前，始终维持减数分裂阻滞于第一次减数分裂前期的双线期。

体内多种物质均可诱导初级卵母细胞减数分裂的恢复信号。下丘脑分泌的促黄体素(LH)对CNP/NPR2信号通路的改变、cGMP动力学变化以及MAPK3/1/MPF信号，均对促进减数分裂恢复起着重要意义。目前研究揭示，由LH诱导的EGF可通过多种途径引起EGFR的反应，不仅降低了CNP和NPR2的表达，而且诱导活化了MAPK3/1信号[13]。LH不仅可以通过降低颗粒细胞中的cGMP的水平，进而使卵母细胞内cGMP 水平也降低，而且还可诱导cAMP-PDE的活化来同样降低cAMP的水平。卵母细胞减数分裂的恢复，正是因为低水平的cAMP会活化MPF。此外，缝隙连接或由卵泡液通过的颗粒细胞可以传导抑制减数分裂的信号，表明抑制细胞间的缝隙连接也可恢复减数分裂[14]。近年研究发现，由CNP抑制的卵母细胞减数分裂，肌苷单磷酸脱氢酶(inosine monophosphate dehydrogenase，IMPDH)抑制剂能够逆转该过程并使其恢复[15]。除此之外，雌性减数分裂阻滞蛋白(meiosis arrest female 1，MARF1)、CRL4(Cullin ring-finger ubiquitin ligase 4)、Zar1(Zygote arrest-1)等物质也在卵母细胞成熟过程中发挥重要作用，但其具体机制还需深入研究[16]。

3 C型利钠肽对卵母细胞减数分裂阻滞的作用

CNP与其受体的结合对维持卵母细胞减数分裂阻滞具有重要作用。在胎儿时期，雌性哺乳动物的卵母细胞便开始进行减数分裂，并阻滞于第一次减数分裂前期的双线期长达几个月至几十年，直至促性腺激素激活其受体引发一系列生理活动来恢复第一次减数分裂。而在体外培养卵母细胞的过程中，由于其脱离了体内卵泡液环境，缺乏LH峰等促性腺激素的刺激，导致细胞核会迅速地自发启动减数分裂，而此时细胞质不完全成熟，出现核质成熟不同步的现象。许多研究表明，卵泡中颗粒细胞上表达CNP的信使RNA，而卵母细胞周围的卵丘细胞上能够检测到CNP受体NPR2信使RNA的表达[17]，而在CNP或NPR2基因突变小鼠，卵母细胞的减数分裂会提前恢复。

3.1 C型利钠肽在哺乳动物体内维持减数分裂阻滞的机制

当哺乳动物性成熟后出现第一次LH峰时，颗粒细胞上CNP表达降低，同时受体NPR2活性迅速下降，cGMP浓度迅速降低，解除PDE3A抑制，使得卵母细胞中cAMP浓度下降，启动减数分裂并排卵。

夏国良等[17]通过原位杂交方式检测了小鼠卵泡中CNP的基因表达在贴近卵泡壁的颗粒细胞上，而其鸟苷酸环化酶受体Npr2的基因主要表达在卵母细胞周围的卵丘细胞上，卵母细胞上不表达CNP 或 NPR2 基因。CNP通过与其受体NPR2结合，具有促进卵丘细胞内cGMP产生的作用，这在仓鼠卵母细胞间情期维持较高的cGMP水平得到证实。在卵丘卵母细胞复合体(cumulus-oocyte complexes，COCs)之间的缝隙连接的辅助下，高浓度的cGMP进入卵母细胞内来抑制磷酸二酯酶3A(PDE3A)的活性[18]，从而达到维持卵母细胞内高水平的cAMP的目的。而cAMP作为维持减数分裂双线期的关键分子，其浓度的下降会导致减数分裂恢复。研究表明，cAMP能够激活蛋白激酶 A(Protein kinase A，PKA)，后者通过磷酸化细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependent kinase，Cdk1)使之与细胞周期蛋白(CyclinB1)结合形成无活性的复合体，即成熟促进因子前体(pre-MPF)[19]。MPF活性受抑制，从而维持卵母细胞第一次减数分裂的阻滞。因此，CNP与NPR结合诱导cGMP产生来抑制卵母细胞内磷酸二酯酶水解cAMP，以通过cAMP-PKA信号使MPF亚基发生磷酸化，抑制其活性，从而阻滞减数分裂，这表明CNP是维持减数分裂阻滞的关键分子，能间接影响卵母细胞的减数分裂。

3.2 C型利钠肽在卵母细胞体外成熟中的应用

卵母细胞体外成熟培养是动物克隆技术、医学辅助生殖技术及农业基因编辑育种等的关键环节。而现阶段卵母细胞体外成熟培养体系尚不能完全模拟哺乳动物体内生理条件下卵子发生和卵泡发育过程，导致获得的成熟卵母细胞数量少、质量差，直接制约了生物医学和农业用途的转基因动物生产试验。1935年，科学家们成功在家兔的未成熟卵母细胞上建立了卵母细胞体外成熟培养技术，但其培养技术尚不成熟，体外培养成熟的卵母细胞的质量远不及体内[20]。诸多研究证明，离开卵泡环境的卵母细胞能够在体外自发成熟，引起核质不同步成熟，表明体内卵泡液中含有某种抑制卵母细胞核成熟的物质来维持卵母细胞第一次减数分裂阻滞，这种物质被称之为卵母细胞成熟抑制因子(OMI)[14]。OMI是一种由颗粒细胞产生并分泌到卵泡液中的环腺苷酸、卵巢固醇类物质或热稳定性多肽[15]，而CNP是人们广泛认可的一种体内OMI。

张通，张峻鸿等人的研究揭示，CNP在各种动物，如牛[21]、山羊[22]、绵羊[23]等的卵母细胞减数分裂阻滞均发挥重要作用。CNP能够通过与NPR2受体结合活化下游cAMP-PKA信号通路，阻滞卵母细胞减数分裂。进一步研究发现，CNP预处理能有效将卵母细胞阻滞于GV期，抑制其减数分裂进程，且能显著提高胚胎的囊胚率[1]。因此，C型利钠肽在体外环境下诱导卵母细胞核质同步成熟，提高成熟卵母细胞的质量及后续发育能力方面发挥关键作用。将其引入IVM体系中，可以有效维持卵母细胞减数分裂停滞状态，促进核质同步成熟，以达到提高IVM卵母细胞质量的目的。

4 生殖衰老

细胞衰老是真核生物中普遍存在的一种现象，而卵母细胞衰老是影响雌性不孕、胚胎发育不良的主要原因之一。目前随着社会发展，农药化学残留、环境污染、医疗风险以及生活压力等因素导致女性生殖系统的加速衰老及高龄女性生育现象的增多，使不孕症、流产及卵巢功能早衰成为影响当今社会人类繁衍与女性身心健康的主要疾病[24]。卵母细胞质量下降是由衰老引起的母源性生育力下降的关键因素，近年研究发现，卵母细胞衰老的主要分子生物学机制有端粒缩短、DNA 损伤修复、线粒体功能和细胞代谢紊乱等[25]。

衰老动物卵母细胞质量较青年动物差这一现象已被诸多研究证实，其主要体现在其卵巢卵母细胞数量显著减少、端粒缩短、凝聚力丧失、减数分裂纺锤体异常和染色体错位等[20]，还会导致非整倍体增多和衰老雌性哺乳动物不孕不育。因此，探究衰老卵母细胞染色体异常分离和错误组装纺锤体的发生机制，通过分子生物学的方法，探寻能够有效遏制卵母细胞质量下降的手段，从而解决高龄产妇流产或畸形胚形成的这一医学难题。目前有研究表明，C型利钠肽能够有效阻滞体外培养成熟的卵母细胞核成熟并能通过某种信号通路促进纺锤体组装关键基因表达，来降低衰老卵母细胞纺锤体异常率，提高卵母细胞质量。因此，揭示C型利钠肽对衰老雌性哺乳动物卵母细胞成熟和减数分裂纺锤体组装的影响及其调控关系是本研究的主要目的。

5 结语

雌性哺乳动物出生后卵母细胞数量不再增加，这些卵母细胞以未成熟的形式储存在卵巢中，其结构被称为原始卵泡。性成熟后，卵母细胞才随卵泡周期性发育而启动成熟分裂。大量研究发现CNP在哺乳动物卵母细胞第一次减数分裂阻滞与恢复的调控中发挥重要作用，已被广泛用于卵母细胞体外成熟培养体系。CNP可以维持哺乳动物卵母细胞减数分裂阻滞，使卵母细胞核成熟和胞质成熟同步化，进而提高卵母细胞的成熟率和后期胚胎的发育能力。

本文对CNP及其受体结构，CNP在卵母细胞减数分裂发挥的作用以及CNP在衰老动物卵母细胞的应用前景进行综述，分析CNP在卵母细胞成熟过程中的作用。旨在通过研究探讨CNP提高衰老动物卵母细胞成熟和受精能力的分子机制，为完善卵母细胞体外成熟培养技术体系，珍稀物种繁殖力保存和高龄产妇人工辅助生殖提供理论支持。