猪源致病性大肠杆菌分离与鉴定方法研究

刘桂梅，王韦华

(渭南职业技术学院，陕西 渭南 714000)

0 引言

大肠杆菌是一种十分常见的动物肠道寄居群，它广泛存在并且时刻威胁着公共卫生安全[1-2]。试验从陕西关中地区的猪养殖场采集猪源致病性大肠杆菌，对其分别进行分离和鉴定。

1 材料来源

无菌采集陕西关中地区猪养殖场的具有感染症状的濒死猪的内脏40份进行分离与鉴定。

2 菌落培养

将所收集的内脏等器官组织每份取出适量加入稀释液进行研磨后过滤离心，再取其上清液接种在培养基上，维持37℃恒温，菌落培养完成后置于4℃环境下保存以备后续实验使用。

3 革兰染色镜检

无菌条件下取出之前培养完成的菌落，然后使用革兰染色进行镜检，染色步骤分为涂片、初染、媒染、脱水、复染、镜检，涂片过程要维持无菌状态，初染要注意将染液完全冲洗干净，复染要维持染液染色30 s，镜检要等到标本片完全干燥后才可以进行，先使用低倍劲和高倍镜最后使用油镜。再将菌落分别接种到麦康凯培养基、伊红美兰琼脂以及SS培养基上，经过37℃恒温过夜培养，观察菌株的生长情况。

4 抗原血清型鉴定

取上述菌落进行接种，培养基为普通琼脂，接种完成后将其置于37℃恒温环境中培养24 h，然后再使用石炭酸生理盐水冲洗培养基，冲洗下菌苔，将其收集于圆底试管中，制成浓稠的悬液，塞上试管的塞子后，对其进行2 h的121℃高压处理，破坏菌落的K抗原。冷却后使用特定血清对其进行玻板凝集反应，再设置一组生理盐水的混合物作为实验组的对照，观察实验组和对照组是否会出现凝集颗粒，并根据这一现象判断菌落所属的血清型。如果在30 s内出现了明显的凝集者表示该反应为阳性。

5 毒力基因检测

首先根据国际国内公布的基因序列，参照相关文献对猪源致病性大肠杆菌设计毒力基因，再对用培养基培养后的细菌进行生理盐水灭菌、洗涤以及稀释后，将其作为细菌的DNA 模板，开始进行PCR检测。PCR检测在温度为94℃的条件下进行10 min，再进行循环、退火等一系列操作后结束反应，反应后的产物经琼脂糖凝胶开始电泳验证。一般为菌落设计9种毒力基因分别进行PCR检测，对其检测结果进行分析讨论。

细菌的DNA模板提取具体过程如下。

1)取少量培养的细菌液于试管内，离心后将上清去除干净。

2)向第一步中所获得的沉淀物也就是细菌菌体加入缓冲液A后，进行振荡直到菌体悬浮，可以满足实验要求。

3)向试管内加入蛋白酶溶液，再次振荡，将菌体与蛋白酶溶液充分混合。

4)再向试管内加入缓冲液B，经过振荡、静置，溶液变得清亮之后，去除掉试管内壁可能存在的水珠。

5)加入无水乙醇，经过振荡后，试管内可能会出现部分絮状沉淀，稍稍离心后，去除掉试管内壁出现的水珠。

6)将步骤5)得到的溶液以及可能会出现的絮状沉淀加入一个吸附柱，再次离心之后将废液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

7)向上一步骤所得的吸附柱内加入缓冲液C，该缓冲液应事先进行加入无水乙醇的处理，再次离心之后将废液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

8)向吸附柱内加入缓冲液D，同样事先进行了加入无水乙醇的处理，离心之后将废液倒掉，吸附柱妥善保存，放置于收集管中。

9)再次重复上一步骤。

10)将吸附柱放置在收集管中并进行离心，将废液倒掉。再将吸附柱在室温条件下静置几分钟，以此来晾干之前材料中尚有残余的漂洗液。

11)最后取出一个干净的离心管，将吸附柱放置其中，滴加洗脱缓冲液，再次静置，离心后将溶液收集起来，存放到离心管内。

6 小白鼠的致病性实验

1)首先制备感染菌液，将分离后的菌株在培养基上进行37℃恒温培养，经过18 h后挑取到肉汤培养基内，再经过12 h的37℃恒温振荡培养。

2)将一定数量的小白鼠等量分为8组，1组5只。其中前7组作为该实验的实验组，最后一组作为该实验的对照组，实验组使用不同的分离菌株进行37℃的恒温培养，再将其注入到小白鼠体内，对照组则只注入营养液，分别注入后观察小白鼠的临床表现。

3)每2 h记录小白鼠的精神状态、进食状况等临床表现，连续观察15 d，记录各小组内小白鼠的死亡情况。

4)发生死亡后对小白鼠进行解剖观察，并将小白鼠的各器官组织在无菌条件下取出后将其制作为病理切片，并再次对其进行细菌分离并鉴定。

7 实验结果分析

1)根据培养基的培养特性以及革兰染色结果来判断分离菌株是否符合大肠杆菌的特征。镜检时看到菌落为短小杆菌，革兰氏呈阴性。把分离细菌之后的培养物接种在麦康凯培养基上并维持37℃进行培养后，菌落表面光滑，呈现湿润的粉红色且菌落的边缘整齐；将其接种到伊红美兰琼脂上并维持37℃进行培养后，菌落光滑反光，呈现黑色或者棕绿色；接种在SS培养基上，维持37℃进行培养后菌落不生长。这些都是符合大肠杆菌的形态以及生理特征。此外对于可疑菌落要对其单独进行氧化酶等实验并使用鉴定系统对其进行鉴定。

2)血清型的鉴定结果要根据玻片凝集实验的结果对猪源致病性大肠杆菌的血清型以及菌株类型进行具体的分析。毒力基因检测、药物的敏感性分析都要根据实验的具体结果进行讨论分析。

3)小白鼠的致病性实验通过实验组与对照组的对比，更为直观地展示了猪源致病性大肠杆菌对动物体内各器官组织的危害。通过该实验可以发现猪源致病性大肠杆菌对小白鼠具有很强的致病性，猪源致病性大肠杆菌对人类和动物存在着极大的威胁，应该引起人们的关注。

8 结语

根据上文所述，猪源致病性大肠杆菌的鉴定与分离方法有了一个较为详尽的思路，但是也应该看到猪源致病性大肠杆菌的研究任重而道远，对于该类细菌的研究已经涉及到了众多学科，包括动物医学、食品卫生安全学以及人类医学等。在当前医疗技术手段下，对于猪源致病性大肠杆菌的感染还没有行之有效的治疗方案和治疗药物，因此人类和动物的预防感染就显得尤为重要，而要想加强对食品安全的监督与检测，就必须寻找更加高效的针对猪源致病性大肠杆菌的鉴定方法和检测手段。