视黄酸对细胞凋亡的调控作用及机制

刘 丽 ， 赵 智 ， 付 琳 ， 张 丽 ， 董贤文 ， 王高富

（1.重庆化工职业学院，重庆 401228；2.中共重庆市委党校 经济管理教研部，重庆400041；3.重庆市畜牧科学院，重庆 402460；4. 重庆市山羊工程技术研究中心，重庆 402460）

视黄酸（RA）是维生素A 在动物机体内的代谢终产物和功能活性物质，维生素A 维持动物机体正常生理代谢功能多是转化为RA 来实现的（Napoli，2020）。 RA 通过调控多种目的基因表达影响生命活动进程，如细胞凋亡、免疫应答等，最终对动物健康和生产性能产生重大影响（Alatshan等，2020）。 在奶牛科学方面， 奶牛乳腺上皮细胞（BMEC）是乳成分合成和分泌的重要场所，其在奶牛的多个泌乳周期中， 循环性的经历发育-分化-退化的生理过程 （Apfs，2020；Boisgard 等，2001）。 目前，对于通过提供不同营养元素满足乳腺的泌乳需要，增强BMEC 的活性和数量，激活BMEC 合成乳成分相关的信号通路， 最终提升BMEC 泌乳性能的研究很多（Zhao 等，2021；Dong等 ，2018；Gao 等 ，2015）。 但 对 于 乳 腺 退 化 和BMEC 凋亡的研究较少。研究表明，乳腺退化期在奶牛泌乳周期中具有重要地位， 是维持和提升奶牛产奶性能的重要影响阶段， 乳腺退化发生异常将会导致奶牛以后的泌乳性能降低 （狄和双等，2009）。 乳腺退化主要是通过细胞凋亡途径，减少BMEC 细胞数量来实现的。 奶牛乳腺退化主要发生在干奶期，研究发现，添加维生素A 可以通过调控BMEC 增殖和凋亡影响奶牛的生产性能。 研究表明，RA 对干奶期BMEC 凋亡和脂肪合成代谢具有显著调控作用（Xu 等，2021）。 但是 RA 对BMEC 细胞凋亡的机制尚不明确。因此，本文主要从RA 的功能作用及体内转运途径、 细胞凋亡及信号通路以及RA 对细胞凋亡的调控3 个方面，阐述RA 对细胞凋亡的影响及调控机制， 以期为研究RA 调控奶牛乳腺退化和细胞凋亡进程，提升奶牛生产性能提供思路。

1 RA 的功能作用及体内转运方式

1.1 RA 功能作用 全反式视黄酸（RA）是维生素A 在机体内的代谢终产物，也是微生素A 在体内发挥生物效用的功能性物质 （Tang 和Gudas，2011）。 维生素A 在视黄醇脱氢酶、视黄醛脱氢酶的作用下，首先经脱氧和双加氧形成视黄醛，而后经不可逆氧化反应形成全反式视黄酸。 近年来研究发现，RA 在细胞增殖、分化、凋亡等方面都具有调控作用（Dos 等，2010）。 RA 发挥生物调控功能的实质是其以视黄酸受体（RAR）家族成员转录因子配体的形式进入细胞核，而后与核内RAR 家族成员结合， 并形成转录活化因子 （Rhinn 和Dollé，2012）。 转运进入细胞核是 RA 发挥生物学功能的关键。

1.2 RA 的体内转运 RA 的生成是在细胞质中发生的，其需要转运到细胞核内，与相应的核受体RARs、视黄醇类 X 受体（RXR）和过氧化物酶体增殖物激活受体 β/δ（PPAR β/δ）等结合才能发挥生物活性功能。 由于RA 的长链脂肪酸结构具有疏水抑制性特征， 其限制了RA 自由的穿过细胞核的水通道，因此需要特定的转运载体（Tang 和Gudas，2011；Noy，2010）。研究表明，一种包括 14~15 kD 分子大小蛋白的家族成员， 即脂结合蛋白家族，它们能够与不同的类维生素A 和长链脂肪酸结合（Storch 和 Corsico，2008）。在脂结合蛋白家族中，RA-结合蛋白-II（CRABP-II）可用作 RA 与RAR 之间的传递，而脂肪酸结合蛋白5 （FABP5）转 运 RA 给 PPAR β/δ （Tan 等 ，2002；Budhu，2001）。 这些转运蛋白（CRABP-II、FABP5）在没有配体RA 存在的情况下常存在于细胞质中， 在与RA 结合后转移到细胞核。 在细胞核内，这些蛋白通过RA 的引导， 特异地与目的受体 （RARs 和PPAR β/δ 等） 相互作用形成复合物。 CRABP-II与 FABP5 因此促进了 RA 分别传递给 RAR 和PPAR β/δ， 并显著提高了相应受体的转录活性（Tan 等，2002；Budhu 和 Noy，2002）。

2 细胞凋亡及信号通路

2.1 细胞凋亡 在动物生命周期中， 一些细胞会在特定的时间死亡，而被清除，这个过程称为程序性细胞死亡。程序性细胞死亡一般是以细胞凋亡的形式发生和实现的（Jacobson 等，1997）。 细胞凋亡作为一种专门的细胞死亡形式，具有其自身专门的调控方式和凋亡细胞生理特征 （Schwartzman 和Cidlowski，1993）。 首先，正常细胞膜上的磷脂酰丝氨酸本身处于细胞膜内侧， 当早期细胞凋亡的时候，细胞会出现生理性的特征，即磷脂酰丝氨酸外翻于细胞膜表面；而后凋亡细胞皱缩与相邻细胞分离，细胞表面变光滑，微绒毛等结构消失；然后细胞骨架的肌动蛋白、 肌球蛋白受损导致质膜出泡，细胞核内染色质凝集，染色质上的核蛋白被核蛋白酶水解而产生DNA 片段，DNA 电泳呈现梯状条带；最后细胞膜内陷，将细胞包裹并分裂成多个凋亡小体， 裂解的细胞被周围的吞噬细胞吞噬（Hengartner，2000；Earnshaw 等，1999）。 细胞凋亡是一种“安静的”细胞死亡方式，不会产生炎症反应。

2.2 细胞凋亡依赖的Caspases 信号通路 天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（Caspase），是一类能够特异水解含天冬氨酸残基底物的半胱氨酸蛋白酶。 Caspase 常以酶原的形式存在， 其自身特点为： （1） 有一个保守的含Cys 残基的活性位点，该位点是酶催化活性所必需的。（2） Caspase 识别底物酶切位点 N 侧的至少 4 个氨基酸残基（P4P3P2P1），P1 必须是 Asp 残基。 （3） Caspase 酶原的活性很低， 需要切除氨基端的一段序列才能被激活（Earnshaw 等，1999）。 Caspase 按结构与功能分为三类：起始Caspase、效应Caspase 和炎症Caspase，典型代表分别为 Caspase-8/-9，Caspase-3/-7/-6 和 Caspase-1（Fan 等，2005）。 细胞凋亡依赖的Caspase 信号通路主要有死亡受体信号通路（亦称为胞外信号通路）和线粒体通路（又称为胞内信号通路）。

2.2.1 死亡受体信号通路 在脊椎动物中， 死亡受体是肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族的一个亚家族，包括肿瘤坏死因子受体1 （TNFR1）、凋亡因子Fas （Fas/CD95） 以及肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）（Bratton 等，2000）。它们与相应的配体（TNF-α，Fas 和 TRAIL）结合后暴露出死亡结构域，从而与接头分子，如Fas 相关结构域蛋白 （FADD） 的死亡结构域相互作用， 并暴露出FADD 分子中含有的死亡效应结构域（DED），DED 与起始Caspase-8 的前结构域上的DED 结合，从而使Caspase-8 二聚化，通过诱导临近效应而 活 化 （Danial 和 Korsmeyer，2004；Lahm 等 ，2003）。 死亡受体、接头蛋白与 Caspase-8 组成了死亡诱导信号复合体 （DISC）。 活化的起始Caspase-8 能激活下游的效应 Caspase-3/-7， 效应Caspase 产物相应的生理功能激活细胞凋亡（Boatright 和 Salvesen，2003）。

2.2.2 线粒体通路 线粒体受到相关刺激后，发生线粒体外膜通透化（MOMP），释放出可溶性蛋白， 而后与凋亡蛋白酶活化因子-1 （APAF-1）结合，使其发生构象变化，从而使dATP 结合到APAF-1 上，使APAF-1 的构象再发生改变，寡聚化后形成7 个APAF-1 组成的复合体， 即凋亡（Bao等，2005；Hill，2003）。 随后在凋亡体中心募集两个Caspase-9，通过诱导临近效应加工活化为具有活性的 Caspase-9。 活化的 Caspase-9 激活效应Caspase-3/-7，从而激活细胞凋亡。 MOMP 的发生是决定细胞“生”与“死”的关键所在，其发生受B淋巴细胞瘤-2 （Bcl-2） 家族蛋白的激活或抑制（Danial 和 Korsmeyer，2004）。 按 Bcl-2 蛋白家族的结构与功能，将其分为三类：抗凋亡蛋白（含有BH-1，-2，-3，-4 四个结构）， 促凋亡的多结构域蛋白（它们都含有 BH-1，-2，-3 结构域），促凋亡的仅含BH-3 结构的蛋白。 抗凋亡的Bcl-2 蛋白主要有 Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w 等 Bcl-2 亚家族蛋白，他们通过抑制MOMP 的形成抵抗凋亡的发生和发展。 多结构域促凋亡Bcl-2 家族蛋白主要有Bax 和Bak，它们被仅含BH-3 结构域的 Bcl-2 家族蛋白激活后， 发生寡聚化在线粒体外膜上形成孔隙，从而释放出线粒体膜间隙中的可溶性蛋白，从而激活下游凋亡信号通路（Muthalagu 等，2014；Danial 和 Korsmeyer，2004）。

2.2.3 胞外、 胞内信号通路的交叉调控与凋亡抑制 凋亡的两条信号通路， 尽管在某些方面存在很大的差异，但在通路中它们相互交叉作用，因此存在 “交叉调控” 的现象 （Danial 和 Korsmeyer，2004）。 胞外通路的Caspase-8 通过裂解并激活只含有BH3 结构域的Bid 蛋白， 从而促进Bax、Bak蛋白对MOMP 的形成， 激活胞内线粒体通路；胞内通路活化的Caspse-9 反过来能够激活胞外通路的效应Caspase-3/-7。

凋亡信号通路活化过程中也受到很多抑制因素的调控，而不是无限制的促进细胞凋亡。既然效应Caspase 可通过裂解而被活化，而这些Caspases又可以相互裂解活化对方， 所以在细胞中， 任何Caspase 的蛋白水解酶活力都能被迅速放大， 进而导致细胞凋亡。 因此，存在一定的机制来限制没有接受死亡信号的细胞中的Caspase 潜在的 “意外”活化极为重要。 X 连锁凋亡抑制因子 （XIAP）是Caspase 的有效抑制因子，尤其能够抑制效应Caspase-3/-7 和起始Caspase-9 的活性。 从而能够抑制死亡受体引起的细胞凋亡（Vaux 和Silke，2005）。MOMP 后释放的线粒体中调节细胞凋亡的蛋白质（Smac）和Omi 能够抑制XIAP 从而活化效应Caspase-3/-7。Bcl-2、Bcl-XL 能够抑制活化的 Bax、Bak从而抑制MOMP 的形成； 此外二者还能够与活化的Apaf-1 结合， 从而抑制凋亡体的形成， 抑制Caspase-9 的激活（Vaux 和 Silke，2005）。

3 RA 对细胞凋亡的调控

视黄酸（RA）能够通过促进细胞凋亡，特别是对肿瘤细胞的促凋亡作用，抑制肿瘤细胞的凋亡。反之，RA 还能够抑制某些正常细胞受到不该受的凋亡刺激后发生的凋亡， 促进这些细胞的生长与健康。 因此，明确RA 对细胞凋亡的调控机制，有利于动物饲养过程中， 在适宜的生长和生产阶段合理运用RA，提升其生物效用，改善动物的生产性能。

3.1 RA 促进肿瘤细胞凋亡

3.1.1 RA 通过Caspases 促进细胞凋亡 Donato和 Noy（2005）以乳腺瘤细胞 MCF-7 为模型，研究发现在 MCF-7 中，DNA 碎片化程度与 RA 的浓度呈剂量依赖关系。 并通过芯片矩阵分析825 个基因的表达量， 发现RA 提高了MCF-7 中Caspase-7、Caspase-9 基因 60%的表达量。而后，为了确定 Caspase-7、Caspase-9 是否是 RA 在转录调控上的直接目标， 进一步研究了蛋白合成抑制剂环己酰亚胺 （CHX） 对 RA 诱导 Caspase-7、Caspase-9 表达的作用。 环己酰亚胺处理会消除蛋白从头合成，但不会影响直接的转录反应。 CHX 添加完全消除了RA 对Caspase-7 mRNA 表达的调控作用， 但对RA 诱导Caspase-9 mRNA 表达上调无影响。 说明RA 对Caspase-7 的作用是间接作用，而Caspase-9 是RAR 信号的直接目标（Do-nato 和 Noy，2005）。 因此，RA 可通过直接作用Caspase-9 对细胞凋亡进行调控。

3.1.2 RA 通过死亡受体通路促进细胞凋亡 有研究发现，RA 提高了头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌细胞系肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体1（TRAIL-R1）蛋白 表达 （Dhandapani 等 ，2011；Danial 和 Korsmeyer，2004）。 RA 处理 细胞 12 h后，TRAIL-R1 发生表达并能维持到 24 h。 RA 添加浓度在100 nmol/L 能显著提高TRAIL-R1 的表达水平。经RT-PCR 检测发现，RA 是在转录水平促进TRAIL-R1 基因表达。 通过RAR 激动剂、拮抗剂以及基因沉默试验研究发现，RA 是通过RAR 核受体调控目的基因TRAIL-R1 的表达。经染色质免疫沉淀分析发现，DR-11 为RA 核受体RAR 调控TRAIL-R1 基因表达的反应元件。死亡受体表达虽增加了，但需要配体的结合才能激发胞外死亡受体通路，从而促进细胞凋亡。 研究发现，在 22B 和 A549 细胞中，RA 与 TRAIL 联合具有更大的效力来降低细胞生长和增加DNA片段化。 因此，RA 是通过激活死亡受体TRAILR1 的表达和提高TRAIL 配体活性来提高死亡受体介导的信号通路。

3.1.3 RA 通过胞内MOMP 促进细胞凋亡 线粒体膜外通透化（MOMP）是细胞凋亡调控的关键环节。MOMP 的发生受Bcl-2 家族蛋白的调控。研究表明，正常情况下Bax 蛋白的NH2-末端处于“掩埋”状态，在受到应激时，Bid、Bim 等能够将其激活，导致NH2-末端残基暴露，从而转移并插入线粒体外膜上（Martinou 和 Youle，2011）。 单克隆抗体 6A7 能够特异识别 Bax NH2-末端。 Niu 等（2001） 用 RA 处理 MCF-7 和 ZR-75 细胞 96 h后，应用6A7 免疫组化发现：与对照组相比，6A7特异性反应的细胞增加大约3 倍， 且线粒体中细胞色素 C 大量释放 （Niu，2001）。 因此，RA 调控Bcl-2 家族蛋白的表达， 影响MOMP 的发生是其调控细胞凋亡的重要途径之一。

3.2 RA 抑制正常细胞凋亡的作用 RA 在抑制凋亡中的重要作用主要体现在：（1）保护受凋亡激活 的 造 血 干 细 胞 （Iwata 等 ，1992；Oritani 等 ，1992）；（2）阻止机械损伤和血管紧张素 II 触发的心肌细胞凋亡（Choudhary，2008）；（3）保护 TNF-a介导的肺上皮细胞凋亡（Besnard 等，2002）；（4）抑制辐射引起的血管内皮细胞凋亡（Sorg 等，2005）。在山羊卵母细胞抗凋亡的研究中发现，RA 上调了山羊卵母细胞抗凋亡Bcl-2 蛋白的表达， 下调了促进凋亡Caspase-8 基因的表达， 最终抑制细胞凋亡 （Pu 等，2014）。 因此，RA 通过增强 Bcl-2蛋白的表达，下调Caspase-8 的活性，是抑制细胞凋亡的途径之一。 此外，RA 可以通过调控其核受体抗细胞凋亡。 Schug 等（2007）研究发现，RA 可以上调PPARβ/δ 目的基因禁食诱导的脂肪因子（FIAF）、脂肪分化相关蛋白（ADRP）、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的表达量，而PDK1 具有通过磷酸化激活存活因子（PKB/Akt）抑制细胞凋亡的作用。

3.3 RA 促凋亡与抗凋亡的平衡调控 促凋亡与凋亡抑制相互制约，两者平衡调控是细胞凋亡调控的关键。RA 既有抑制凋亡的作用，又有促凋亡的作用。 研究发现，RA 通过 CRABP-II 上调 RAR 的反应元件（RARE），通过脂肪酸结合蛋白（FABP5）上调过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）的反应元件PPRE。比较CRABP-II 与FABP5 在肿瘤细胞与正常细胞中的表达水平发现，CRABP-II 的表达在癌细胞中表达量显著降低， 而FABP5 的表达量显著升高。 因此， 肿瘤的发生伴随着CARBP-II/FABP5 比例的显著降低。研究发现，当RA 存在时，乳腺癌细胞中CARBP-II/FABP5 的比例升高。通过转染FABP5 表达型质粒载体， 以及CARBP-II siRNA 干扰使CARBP-II/FABP5 的比例发生翻转。比例翻转前，RA 少量直接作用于 PPARβ/δ 和它的目的基因 PDK1。 比例翻转后，RA 显著促进了PDK1 的释放，抑制了细胞的凋亡。 因此，RA 对细胞促凋亡和抑制凋亡的平衡调控作用受到CARBP-II/FABP5 比例的影响。

4 小结

细胞凋亡控制着细胞的生与死， 对动物机体的正常生长和生产具有重大影响。视黄酸（RA）作为重要营养元素维生素A 的代谢终产物和功能活性物质， 具有通过调控细胞凋亡的方式影响动物生长和生产的功能。RA 调控细胞凋亡主要是通过Caspases 信号通路、 死亡受体信号通路和MOMP信号通路。 其核心过程为RA 经CARBP-Ⅱ和FABP5 两种转运载体转运进入细胞核， 而后RA进入细胞核与相应核受体RAR 和PPARβ/δ 结合，通过激活核受体目的基因的反应元件调控相应基因的转录水平， 最终行使细胞凋亡调控功能。CARBP-Ⅱ和FABP5 两种转运载体的比例决定了RA 是促进细胞凋亡还是抑制细胞凋亡， 但是RA是否对CARBP-Ⅱ和FABP5 两种转运载体的比例具有调控作用尚不明确。 此外，RA 对于细胞凋亡调控方面的研究主要集中于人类健康和疾病防治方面，对于动物生长、发育方面的研究还不多。 因此，有必要加强RA 对动物机体生长发育调控方面的研究，以期为RA 或维生素A 的合理使用，提高动物生产性能提供理论支持和研究方向。