微塑料聚乙烯、聚氯乙烯对大型蚤的毒性作用研究

祝慧玲 宋怡彤

摘要：本实验以大型蚤为模式生物，探讨两种微塑料对大型蚤的生长、繁殖及营养状况等毒性效应。结果表明，5 μm粒径的PE和PVC对大型的LC50-96h值分别为199.99 mg·L-1和48.19 mg·L-1，两种微塑料暴露21 d后，PE和PVC显著抑制大型蚤的脱皮数和心率以及降低大型蚤体内蛋白质的含量.

关键词：微塑料，PE，PVC，毒性效应

Study on the Toxicity of Polyethylene and Polyvinyl Chloride to Daphnia magna in microplastics

Zhu Huiling，Song Yitong

Department of biology and environmental engineering，Zhejiang Shuren University，Hangzhou，310015，China

Abstract：In this experiment，Daphnia magna was used as a model organism to investigate the toxic effects of two microplastics on the growth，reproduction and nutritional status of Daphnia magna.The results showed that the LC50–96 h values of PE and PVC with 5μm particle size for Daphnia magna were 199.99 mg·L-1and 48.19  mg·L-1，respectively.After exposure to two microplastics for 21 days，PE and PVC significantly inhibited the desquamation number and heart rate of Daphnia magna and reduced the content of protein in Daphnia magna.Keywords：microplastics，PE，PVC，toxic effects，mechanism

1.引言

微塑料（MPs）是指直径小于5 mm的塑料碎屑和颗粒，其作为一种新兴环境污染物已引起了全球研究学者和公众的广泛关注。目前的研究证明，微塑料广泛存在于全球海洋、地表水、土壤、沉积物和空气等环境介质中，微塑料的来源、分布、毒理效应、生态及健康风险已成为研究热点[1]。水环境中最常检测到的微塑料主要包括聚乙烯（PE）、聚氯乙稀（PVC）、聚丙稀（PP）、聚苯乙烯（PS）等。其中PE是乙烯经聚合制得的一种热塑性树脂，主要用于身体、面部磨砂膏等个人护理用品和食品包装膜、水瓶等;PVC是氯乙烯单体在过氧化物、偶氮化合物等引发剂或在光、热作用下按自由基聚合反应机理聚合而成的聚合物，主要用于排水管、电线、电缆、插销、汽车材料、医疗器械等。我国是PE、PVC的生产和消费大国，2019年的消费量分别达到3383万吨和2027万吨[2]。微塑料在水环境中漂浮、沉积和转移，不可避免地与浮游生物发生接触，了解微塑料对浮游生物的影响是评价其生态风险的重要依据。对于水生植物而言，微塑料的存在会降低下层水体的透明度，从而抑制其光合作用;而对于水生动物，当微塑料尺度小于动物摄食口器的大小时则可以直接进入动物体内，通过食物链在营养级之间转移，危害大型水生动物和整个水生态系统。此外，微塑料还可能吸附环境中的其他污染物而构成复合污染[3]。枝角类是淡水生态系统中物质循环和能量流动中的重要环节，它们对毒物有很强的敏感性。由于大型蚤在水生态系统食物网中的优越性地位，且生殖周期短、繁殖迅速、对水体中有害污染物敏感（在各种环境压力下，表现出生殖力下降、活动抑制等行为异常）等特点，使其作为国际公认的标准试验生物广泛应用于水环境质量评价和水生生态毒理学研究中[4]。美国环保局于1978年将大型蚤定为毒性试验的必测项目，建立了大型蚤急性毒性测试的标准方法。1991年，我国也建立了相关标准方法[5]，塑料降解过程产生的一系列的胁迫因子不可避免地会对大型蚤產生影响，研究微塑料对大型蚤的毒性对评价微塑料的生态效应具有重要的意义[6]。

本研究以PE和PVC为研究对象，以水环境初级消费者大型蚤为模式生物，通过探讨两种微塑料PE和PVC对大型蚤的急性毒性致死率以及21d慢性药物暴露对大型蚤的生长、繁殖及体内蛋白质含量等毒性效应，评价PE、PVC对水生态环境的影响及可能的健康风险，为微塑料类物质的生态危害及可能的健康风险评价提供科学依据。

2.实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1模式生物大型蚤和其食物斜生栅藻的实验室驯养

大型蚤（Daphnia magna）是购自武汉科乐多生物科技有限公司大型蚤62 D.M生物株。选用OECD M4培养基作为大型蚤的培养液，培养条件为pH 7.8±0.2，硬度250 mg·L-1±25 mg·L-1（以CaCO3表示），Ca/Mg摩尔比接近4：1，溶解氧浓度大于2 mg·L-1。大型蚤培养4代后，以出生6-24 h的同批幼蚤进行毒性试验。斜生栅藻购自中国科学院水生生物研究所，以水生4号（HB-IV）人工培养液作为斜生栅藻的培养基。所有使用到的玻璃器皿及培养液均经过HVE-50自动高压灭菌器121℃高温灭菌30 min，冷却后置于超净工作台内，用紫外线照射灭菌30 min，避免藻种受到其他藻类和细菌的污染。接种方法：用1000 mL三角烧瓶移取400～600 mL新鲜的水生4号培养基，接入藻种使之成为淡绿色。接种完成后用八层灭菌过的无纺纱布封口防止藻液受到污染，并标上接种日期和种类，移至智能人工气候箱中培养。培养条件：光暗比12 h：12 h，光照强度2000 lux左右，培养温度25℃左右，每天定期摇瓶5～6次防止藻种老化沉淀，以5-6天的频率接种一次。经常镜检观察藻种是否单一（形状上观察）、有无其它杂菌。预培养3代，镜检细胞正常，进入对数生长期时进行试验。

2.1.2PE和PVC测试液的配制

低密度聚乙烯（PE）和聚氯乙烯（PVC）购自上海阳励机电科技有限公司，均为5 μm优级纯微粉。试验所用其余试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。分散剂Tween80溶液的配置：先用移液枪取1.5μL的分散剂Tween80加入到含100mL大型蚤M4培养基的烧杯中，在漩涡振荡器上震荡30s后，超声分散30min，即得到分散剂溶液。称取0.04g粉末状聚乙烯（或聚氯乙烯）颗粒于100mL分散剂溶液中，在漩涡振荡器上震荡1min后，超声分散30min，得到400mg/L的聚乙烯（或聚氯乙烯）测试液。其他浓度配制方法同理。

2.2 PE和PVC对大型蚤的急性毒性

按照ISO标准试验方法进行聚乙烯和聚氯乙烯对大型蚤的急性毒性试验。试验容器为洁净的50 mL小烧杯，盛20 mL试验溶液，每个烧杯中放入5只刚出生6-24h的幼蚤，PE和PVC的大型蚤暴露浓度均设置为0、12.5、25、50、100、200、400 mg·L-1，水温20～22°C，光照周期为16h光照：8h黑暗，试验期间不喂食，每个浓度5组平行，连续暴露96 h后，分别记录大型蚤24、48、72、96 h的死亡情况，计算两种微塑料对大型蚤的致死率并采用SPSS17.0进行单因素方差分析，计算PE和PVC对大型蚤半数致死浓度LC50值。

2.3 PE和PVC对大型蚤的生长繁殖等慢性毒性

根据急性毒性试验求得的两种微塑料对大型蚤LC50值，慢性试验的PE浓度设置分别为0、12.5、25、50、100 mg·L-1;PVC浓度设置为0、3、6、12、24 mg·L-1，慢性毒性试验按照OECD标准方法。每个烧杯中放1只刚出生6-24h的幼蚤，每浓度设置10个平行，染毒过程中保证蚤类的生活环境适宜和食物充足，并且每天定时观察、记录和分离幼蚤，每3d更换一次培养液，其余条件与急性毒性试验相同。每天记录大型蚤脱皮情况并且及时移出。试验21 d后统计两种药物各浓度下的脱皮数，并于XD-202倒置生物显微镜下测定大型蚤的心率。心率的测定步骤：使用XD-202倒置生物显微镜对每组随机挑选3只大型蚤进行1min的录像，然后使用计数器对录像结果进行大型蚤跳动次数的计数，每个视频计数三次。

2.4 PE和PVC对大型蚤蛋白质含量的影响

取暴露21 d的大型蚤，超纯水冲洗干净并吸干水分后称重，加入3 mL0.9%的生理盐水，在冰水浴条件下超声破碎 15 min机械匀浆，匀浆液于高速冷冻离心机中4℃、15000 r·min-1离心10 min后，采用考马斯亮蓝法测定大型蚤蛋白质含量。步骤：准确称取10 mg牛血清白蛋白，溶于100 mL蒸馏水中，即为100 ug·mL-1的原液。称取100 mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50 mL90%乙醇中，加入85%（W/V）的磷酸100 mL，最后用蒸馏水定容到250 mL。取6 支10 mL 干净的离心管，按表1 取样。盖塞后混合，放置2 min 后用1 cm 光经的比色杯在595 nm 波长下比色，记录各管測定的光密度OD595 nm，并做标准曲线。取10 mL 离心管 ，按下表取样。吸取提取液0.2 mL，放入离心管 中，加入5 mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2 min 后用1 cm 光径比色杯在595 nm 下比色，记录光密度OD 595 nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。

2.5 数据处理

实验所得数据使用origin8.0进行处理和作图，采用SPSS17.0进行单因素方差分析（ANOVA），并用Duncan法进行多组样本间差异显著性分析检验，p<0.05为差异显著。数据结果采用means±SD的方法。

3.结果与讨论

3.1 PE和PVC对大型蚤的急性毒性

图1为PE和PVC对模式生物大型蚤24h、48h、72h、96h的急性毒性影响结果。由图可得出，在浓度为12.5mg·L-1的PE和PVC暴露组，模式生物大型蚤均出现死亡，随着时间的推移，尤其以PVC暴露下的大型蚤死亡率最为明显，而PE暴露组大型蚤死亡率则微有波动。两种微塑料对模式生物大型蚤的致死作用会随着时间的推移而加大，由图可见，微塑料PVC暴露组下的大型蚤死亡率增大较微塑料PE暴露组明显。微塑料PE暴露组在24h急性毒性作用下，模式生物大型蚤未出现死亡，也说明了微塑料PE对大型蚤的急性致死作用要稍低于微塑料PVC。微塑料PE在分散剂Tween80作用下在纯水中呈悬浮状态，而微塑料PVC呈现乳浊液，所以随着时间的增加模式生物大型蚤的死亡率增大，微塑料PE暴露组50mg·L-1浓度下，大型蚤的死亡率和400mg·L-1浓度暴露组相当，原因是随着时间的推移，微塑料PE慢慢聚集，50mg·L-1浓度下微塑料聚集度不高刚好可以被大型蚤摄取，而100mg·L-1和200mg·L-1浓度下的微塑料PE聚集度过大，导致大型蚤无法摄取。微塑料对大型蚤的致死原因不仅表现在大型蚤摄入体内产生的消化道等堵塞，还会缠在大型蚤身上，使得大型蚤游动能力下降而死亡，所以在400mg·L-1浓度下，大型蚤死亡的原因可能是游动能力受到了束缚而致死。微塑料PVC在纯水中呈乳浊液，随着时间增加，会有部分沉在烧杯底部，所以其对大型蚤的致死情况也表现出在微塑料100mg·L-1与400mg·L-1浓度下相当。

实验求得PE和PVC对大型蚤的LC50-96h值分别为107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1。李勤和方海燕等分别了考察了不同粒径大小的PVC对大型蚤的急性毒性作用发现，15 μm的PVC微塑料对大型蚤LC50-96h为130.1 mg·L-1 [7];2 μm的PVC对大型蚤48 h LC50为20.5 mg·L-1 [8]，与本实验结果相当。

3.2 PE和PVC对大型蚤脱皮数和心率的影响

经过21d的微塑料PE和PVC的慢性暴露，各浓度组仅有少数大型蚤死亡。微塑料PE暴露组12.5mg·L-1浓度第10天死亡1只、50mg·L-1浓度第19天死亡1只、100mg·L-1浓度第6天死亡1只;微塑料PVC暴露组6mg·L-1浓度第13天和第17天各死亡1只。脱皮数是大型蚤生长的一个指标，大型蚤每脱一次皮代表大型蚤生长发育一回。微塑料PE和PVC两种药物暴露21d的慢性毒性试验，每天观察大型蚤的繁殖代谢情况，记录每只母蚤在实验期间的蜕皮数，21d后统计总脱皮数。微塑料PE暴露组从小到大各个浓度下21d大型蚤的脱皮总数分别为61个、61个、69个、57个;微塑料PVC暴露组从小到大各个浓度下21d大型蚤的脱皮总数分别为77个、76个、73个、71个，与对照组脱皮数84个相比均低于对照组。表明两种药物暴露阻碍了大型蚤的生长，对其生长发育产生了抑制作用。

试验21 d后于XD-202倒置生物显微镜下测定大型蚤心率，由图2大型蚤于两种微塑料中暴露21 d后的心率变化结果可见，12.5～100 mg·L-1 PE作用下大型蚤的心率分别相当于对照值的81.5%、79.8%、72.8%和70.1%;3～24 mg·L-1 PVC作用下的大型蚤的心率分别相当于对照值的89.4%、80.1%、69.9%和61.8%，均显著低于对照。说明在两种微塑料药物的暴露下，大型蚤的心脏功能发生了变化，会降低机体内的物质循环的速率，导致大型蚤对摄入体内的食物的消化吸收能力降低，从而加速大型蚤的死亡。对比两种微塑料对大型蚤心率的影响来看，微塑料PE暴露组大型蚤的心率呈现陡坡式下降，而微塑料PVC暴露组大型蚤的心率呈直线型下降。且两种微塑料的最高浓度组PVC24 mg·L-1的心率比 PE100 mg·L-1的心率更低，由此可以看出，微塑料PVC暴露组对大型蚤心率的影响较微塑料PE暴露组更大。

3.3 PE和PVC对大型蚤蛋白质含量的影响

蛋白质是评价大型蚤营养状况的指标之一，当大型蚤长时间暴露在微塑料中，微塑料会进入大型蚤消化道造成消化道堵塞，导致大型蚤摄入体内的食物长时间无法消化，体内蛋白质含量降低;再者，大型蚤把微塑料当成食物摄入体内造成饱腹感，而微塑料在体内无法被大型蚤消化吸收，所以导致大型蚤体内蛋白质含量下降。

由图3大型蚤于两种微塑料中暴露21 d后体内蛋白质含量变化结果可见，微塑料PE暴露组随着浓度的增加，模式生物大型蚤体内的蛋白质呈阶梯型下降的趋势。而相对于微塑料PE暴露组，微塑料PVC暴露组大型蚤体内的蛋白质含量随着浓度逐渐增大下降的趋势比较平缓，尤其是浓度0～12 mg·L-1 大型蚤体内蛋白质含量下降趋势微小，而浓度为24mg·L-1 大型蚤体内蛋白质含量显著下降。我们猜测，微塑料PE经分散剂Tween80分散后在纯水中呈悬浮状，颗粒较大，大型蚤摄入体内后产生的饱腹感以及造成肠道堵塞的程度大，所以随着浓度的增加，大型蚤体内蛋白质含量呈明显的下降趋势。而微塑料PVC经分散剂Tween80分散后是乳浊液，形态与大型蚤摄入体内的食物斜生栅藻相似，在一定浓度范围内对大型蚤肠道内的堵塞程度不明显，大型蚤对食物的消化能力没有受到很大程度上的限制，但當微塑料PVC浓度达到一定程度，大型蚤肠道堵塞严重，影响了其对食物的消化，抑制了体内蛋白质的合成，所以当浓度为24 mg·L-1 时，大型蚤体内蛋白质含量出现了急剧降低的现象。

4.结论与应用前景展望

（1） 96 h的急性毒性试验求得5 μm粒径的PE和PVC对大型的LC50-96h值分别为107.98mg·L-1和26.81 mg·L-1，表明相同条件下PVC对大型蚤的急性毒性较PE更强。

（2） PE和PVC两种微塑料暴露21 d后，较高浓度的PE和PVC对大型蚤生长和繁殖等生命活动均具有显著影响。表现为大型蚤的脱皮数减少，在XD-202倒置生物显微镜下测得的大型蚤心率下降，说明两种药物对大型蚤的生长发育产生了抑制作用。

（3） PE和PVC两种微塑料暴露21d后，模式生物大型蚤体内的蛋白质含量随着药物浓度的升高而呈现明显下降的趋势，表面两种微塑料对大型蚤的营养状况产生了危害作用。

（4）微塑料是一种新型环境污染物，成为了近年来比较热门的研究对象，国内对微塑料毒性的探索还在比较浅层的阶段。微塑料不仅会对水环境、大气环境、土壤环境等造成危害，而且对生物及人类的危害是不可估量的。由于微塑料毒害的潜在性和漫长性，人们容易忽视它的存在，但是现阶段对微塑料的研究以及探索解决微塑料污染的办法是人们亟待解决的问题。对微塑料毒性的探索是一个永无止境的过程，它将会是人类探索道路上的一大挑战。

参考文献

[1]骆永明，施华宏，涂晨，等.2021.环境中微塑料研究进展与展望[J].科学通报，66：1547-1562.

[2]许江菱.2021.2019～2020年世界塑料工业进展（Ⅰ）：通用塑料[J].塑料工业，49（3）：1-9.

[3]惠进，龙遥跃，李紫莹，等.微塑料污染对浮游生物影响研究进展[J].应用生态学报，2021，32（7）：2633-2643.

[4]巩宁，孟紫强，邵魁双，孙野青.水蚤分子生态毒理学研究进展.生态毒理学报，2020，15（2）：11⁃18.

[5]高磊.2011.印染废水的生物毒性测试方法研究.成都，西南大学.

[6]方海燕，谢冰寒，侯淼淼，等.2021.PVC微塑料对大型溞繁殖及应激与能量相关基因表达的影响[J].环境科学学报，41（5）：2056-2062.

[7]李勤，李尚谕，熊雄，等.2021.微塑料对大型溞的急性毒性研究[J].水生生物学报，45（2）：1-7.

[8]方海燕，谢冰寒，侯淼淼，等.2021.PVC微塑料对大型溞繁殖及应激与能量相关基因表达的影响[J].环境科学学报，41（5）：2056-2062.

作者简介：祝慧玲（1998-），籍贯：浙江衢州人，浙江树人大学，大学本科，毒理学方向。