钩藤的生物碱构成及其抗炎活性研究

龚 爽，熊 凤，张兴杰，张芮菡，李晓莉，肖伟烈

(云南大学教育部自然资源药物化学重点实验室，云南省天然产物转化与应用重点实验室，化学科学与工程学院，云南 昆明 650500)

根据《中国药典》2015版[1]的记载，茜草科植物钩藤U.rhynchophylla的干燥带钩茎的茎叶作为其正品来源之一，具有息风定惊、清热平肝的功效，可用于治疗肝风内动、惊痫抽搐、高热惊厥、感冒夹惊、小儿惊啼、妊娠子痫、头痛眩晕等.其植物主要分布在在云南、贵州、福建、广西、广东等地.先前研究表明钩藤属植物中含有生物碱[2]、黄酮[3]和三萜[4-5]等化学成分.为了更好地研究钩藤的生物碱成分，并研究其中具有潜力的抗炎活性成分，本实验对钩藤甲醇提取物氯仿相的化学成分进行了系统研究，从中分离并鉴定了18个化合物，分别为dihyrdocorynantheine（1），isocorynantheidine（2），毛钩藤碱（3），柯楠因碱（4），去氢毛钩藤碱（5），蓬籽嗪甲醚（6），villocarine A（7），16R-E-isositsirikine（8），sitsirikine（9），19，20-dihydroisositsirikine（10），去氢毛钩藤N-氧化物（11），geissoschizine N-oxide methyl ether（12），柯诺辛碱（13），异钩藤酸（14），异柯诺辛因碱（15），柯诺辛碱B（16），去氢钩藤碱（17），阿枯阿米精（18），化合物结构见图1.化合物2，7，8和10为首次在该植物中分离得到.通过炎症小体的实验，对分离得到的化合物的抗炎活性进行了筛选，结果表明化合物13具有一定的抗炎活性.

图1 钩藤生物碱1～18的结构Fig.1 The structure of alkaloid constituents 1-18 from Uncaria rhynchophylla

1 仪器与材料

AV-400、AV-III-600 HD核磁共振仪（德国Bruker公司）；旋转蒸发仪（东京理化公司）；薄层层析分析GF254型硅胶板，0.054～0.077 mm（200～300目）、0.172～0.216 mm（80～100目）柱色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；75～150μm MCI填料（日本三菱化工公司）；Sephadex LH-20（瑞士Pharmacia公司）；0.077～0.172 mm（100～200目）层析用氧化铝（上海五四试剂化学有限公司）；Agilent1260分析型高效液相色谱、G7161A制备型高效液相色谱（美国Agilent公司）；Zorbax SBC18（φ9.4 mm×250 mm）半 制 备 柱、Zorbax SBC18（φ4.6 mm×250 mm）分析柱（美国Agilent公司）；XSelect CSH C18 OBD（φ30 mm X 100 mm）半制备柱（美国Waters公司）；色谱纯乙腈溶剂（CINC公司）；UPLC-IF-TOF质谱仪（美国Agilent公司）；所用溶剂均为分析纯（昆明腾科科技有限公司）.

钩藤带钩茎的茎叶于2019年采自云南省文山市坝心彝族乡，由昆明采智生物有限公司采集及鉴定，标本保存于云南大学教育部自然资源药物化学重点实验室.

2 提取与分离

钩藤干燥带钩茎的茎叶21 kg，粉碎后用甲醇常温浸泡提取3次，每次24 h，提取液浓缩去除甲醇后以适量水混悬，加入酒石酸调节pH值至pH=2～3，用乙酸乙酯萃取3次，将乙酸乙酯部分浓缩.剩余水相用氨水调节pH至9～10，然后用氯仿萃取3次得到钩藤总生物碱部分，浓缩氯仿相，得到浸膏450 g.氯仿相浸膏经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇（体积比100∶1→0∶100，下同）进行梯度洗脱，得到组分Fr.1～7.

组分Fr.3段经氧化铝柱经石油醚-乙酸乙酯（4∶1→0∶1）洗脱，得到4个组分.Fr.3-2经过正相硅胶柱色谱多次分离纯化，最后通过HPLC分离得到化合物11（15.3 mg），洗脱条件为乙腈-水（45∶55，含5‰二乙胺），流速为3.0 mL/min，检测波长230、254、280 nm.

组分Fr.4段经氧化铝柱用石油醚-乙酸乙酯（2∶1→0∶1）洗脱，得到7个组分，Fr.4-1通过氧化铝柱色谱用石油醚-乙酸乙酯（4∶1→0∶1）洗脱，得到9个组分.经过多次硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、氧化铝柱色谱分段富集，得到化合物6（1 156.4 mg），化合物7（13.5 mg），化合物12（7.5 mg）. 通过半制备HPLC，分离得到化合物1（132.6 mg），化合物2（7.7 mg），化合物4（22.1 mg），化合物5（18.5 mg），化合物18（7.0 mg），洗脱条件为乙腈-水（60∶40，含5‰二乙胺），流速为3.0 mL/min，检测波长分别为230、254、280 nm.

组分Fr.4-5通过氧化铝柱色谱用石油醚-丙酮（4∶1→0∶1）洗脱，得到5个组分.通过多次硅胶柱色谱，从组分Fr.4-5-1中得到化合物13（90.7 mg）.组分Fr.4-5-3、Fr.4-5-4和Fr.4-5-7使用半制备HPLC分离得到化合物3（56.2 mg），化合物8（6.1 mg），化合物9（12.9 mg），化合物10（38.9 mg），化合物14（7.7 mg），化合物15（4.0 mg），化合物16（5.5 mg），化合物17（3.4 mg），洗脱条件为乙腈-水（59∶41，含5‰二乙胺），流速为3.0 mL/min，检测波长分别为230、254、280 nm.

3 结构鉴定

化合物1棕色固体，C22H28N2O3.1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.58（1H，d，J=7.4 Hz，H-9），7.38（1H，d，J=7.6 Hz，H-12），7.20（2H，m，J=6.9 Hz，H-10，H-11），3.86（3H，s，17-OMe），3.80（3H，s，22-OMe）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：169.8（C-22），160.2（C-17），136.2（C-13），134.9（C-20），127.2（C-8），120.9（C-10），119.0（C-11），117.9（C-9），111.5（C-16），110.8（C-12），107.4（C-7），61.6（17-OMe），60.7（C-21），60.3（C-3），53.0（C-5），51.5（22-OMe），39.9（C-20），38.3（C-15），33.3（C-14），24.3（C-19），21.5（C-6），11.1（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[6]，故鉴定化合物1为dihyrdocorynantheine.

化合物2棕色固体，C22H28N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.45（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.34（1H，d，J=8.3 Hz，H-12），7.28（1H，s，H-17），7.10（1H，m，H-11），7.05（1H，t，J=7.4 Hz，H-10），3.82（3H，s，17-OMe），3.74（3H，s，22-OMe），1.14（3H，t，J=7.4 Hz，H-18）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：172.8（C-22），159.7（C-17），136.3（C-13），135.3（C-2），127.4（C-8），121.3（C-11），119.4（C-10），118.2（C-9），112.7（C-16），110.9（C-12），108.6（C-7），62.1（C-21），61.6（17-OMe），56.3（C-3），51.5（C-5），51.5（22-OMe），36.4（C-20），31.3（C-15），29.8（C-14），21.7（C-6），18.3（C-19），12.9（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[7]，故鉴定化合物2为isocorynantheidine.

化合物3淡黄色固体，C22H28N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.16（1H，s，1-NH），7.50（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.36（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.32（1H，s，H-17），7.15（1H，t，J=7.4Hz，H-11），7.11（1H，t，J=7.4Hz，H-10），4.46（1H，s，H-3），3.75（3H，s，17-OMe），3.68（3H，s，22-OMe），3.31（2H，t，J=5.3Hz，H-5），3.03（1H，m，H-6α），2.78（1H，dd，J=11.2，3.3 Hz，H-21α），2.57（1H，dd，J=15.8，4.5 Hz，H-6β），2.45（1H，m，H-14α），1.99（1H，d，J=13.4 Hz，H-14β），1.29（1H，m，H-19α），0.76（3H，d，J=4.9 Hz，H-18），0.75（1H，m，H-19β）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：169.1（C-22），159.8（C-17），136.0（C-13），133.5（C-2），128.0（C-8），121.3（C-10），119.3（C-11），118.0（C-9），112.0（C-16），111.2（C-12），107.9（C-7），61.5（17-OMe），54.3（C-3），51.5（C-5），51.3（22-OMe），50.8（C-21），39.2（C-20），35.1（C-15），31.9（C-14），24.4（C-19），17.1（C-6），11.4（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物3为毛钩藤碱.

化合物4棕色固体，C22H26N2O3.1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.84（1H，s，1-NH），7.39（1H，d，J=7.4 Hz，H-9），7.20（1H，d，J=7.5 Hz，H-12），7.19（1H，s，H-17），7.02（2H，m，H-10，H-11），5.49（1H，dd，J=17.5，8.9 Hz，H-19），4.91（2H，dd，J=18.8，14.1 Hz，H-18），3.68（3H，s，17-OMe），3.62（3H，s，22-OMe），3.38（1H，s，H-3）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：169.0（C-22），160.0（C-17），139.5（C-19），136.2（C-13），135.0（C-2），127.5（C-8），121.3（C-11），119.4（C-10），118.2（C-9），115.6（C-18），111.7（C-16），110.9（C-12），108.1（C-7），61.7（17-OMe），61.5（C-21），60.2（C-3），53.0（C-5），51.4（22-OMe），42.9（C-20），38.9（C-15），33.5（C-14），21.9（C-6）.以上数据与文献报道基本一致[9]，故鉴定化合物4为柯楠因碱.

化合物5棕色固体，C22H26N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.25（1H，s，H-17），7.15（1H，t，J=7.5 Hz，H-11），7.10（1H，t，J=7.7 Hz，H-10），5.34（1H，m，H-19），4.91（1H，dd，J=17.2，1.5 Hz，H-18α），4.83（1H，dd，J=10.3，2.0 Hz，H-18β），4.45（1H，dt，J=5.0，2.6 Hz，H-3），3.74（3H，s，17-OMe），3.66（3H，s，22-OMe），3.29（2H，d，J=6.2 Hz，H-5），3.02（1H，ddt，J=15.4，8.1，2.5 Hz，H-6α），2.95（1H，ddd，J=11.4，8.4，4.1 Hz，H-6β）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：168.9（C-22），159.7（C-17），139.6（C-19），136.1（C-13），133.2（C-2），128.1（C-8），121.4（C-10），119.4（C-11），118.1（C-9），115.3（C-18），111.9（C-16），111.3（C-12），108.1（C-7），61.5（17-OMe），54.2（C-3），51.4（C-5，C-21，22-OMe），43.2（C-20），34.3（C-15），31.3（C-14），17.1（C-6）.以上数据与文献报道基本一致[8]，故鉴定化合物5为去氢毛钩藤碱.

化合物6棕色固体，C22H26N2O3.1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：7.41（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.32（1H，d，J=7.6 Hz，H-12），7.33（1H，s，H-17），7.10（1H，t，J=7.2Hz，H-11），7.04（1H，t，J=7.3 Hz，H-10），5.47（1H，d，J=7.0 Hz，H-19），3.83（3H，s，17-OMe），3.73（2H，m，H-3，15），3.69（3H，s，22-OMe），3.63（1H，m，H-21α），3.37（1H，d，J=12.1 Hz，H-21β），3.10（1H，m，H-5α），2.88（3H，m，H-5β，6α，6β），2.28（1H，m，H-14α），1.99（1H，m，H-14β），1.47（3H，d，J=7.0 Hz，H-18）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：168.5（C-22），159.8（C-17），136.4（C-13），133.3（C-2），132.6（C-20），126.9（C-8），123.6（C-19），121.6（C-11），119.4（C-10），118.2（C-9），112.0（C-16），111.2（C-12），107.8（C-7），63.0（C-21），61.9（17-OMe），57.5（C-3），51.5（22-OMe），50.6（C-5），35.3（C-15），33.1（C-14），20.8（C-6），13.2（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[10]，故鉴定化合物6为蓬籽嗪甲醚.

化合物7棕色固体，C22H26N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.45（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.34（1H，d，J=8.3 Hz，H-12），7.28（1H，s，H-17），7.10（H，m，1H-11），7.05（1H，t，J=7.4 Hz，H-10），5.43（1H，q，J=7.0 Hz，H-19），3.86（3H，s，17-OMe），3.70（3H，s，22-OMe），1.54（3H，d，J=7.0 Hz，H-18）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：172.2（C-22），158.9（C-17），136.3（C-13），135.3（C-2），134.6（C-20），127.6（C-8），122.4（C-19），121.4（C-11），119.4（C-10），118.2（C-9），112.7（C-16），110.9（C-12），108.3（C-7），62.1（C-21），61.9（17-OMe），56.3（C-3），52.8（C-5），51.5（22-OMe），35.9（C-14），31.3（C-15），21.5（C-6），13.2（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[11]，故鉴定化合物7为villocarine A.

化合物8黄色固体，C21H26N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.68（1H，s，1-NH），7.47（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.38（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.16（1H，t，J=7.6 Hz，H-11），7.10（1H，t，J=7.5 Hz，H-10），5.63（1H，q，J=6.7 Hz，H-19），3.81（3H，s，22-OMe），3.50（1H，d，J=4.8 Hz，H-21α），3.26（1H，dd，J=13.0，5.0 Hz，H-5α），3.13（2H，m，H-6），2.92（1H，d，J=12.1 Hz，H-21β），2.63（1H，dd，J=15.7，4.8 Hz，H-5β）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：175.6（C-22），136.4（C-13），134.2（C-20），133.7（C-2），127.8（C-8），123.6（C-19），121.7（C-11），119.7（C-10），118.1（C-9），111.4（C-12），108.0（C-7），62.3（C-17），52.9（C-3），52.6（C-21），52.4（22-OMe），51.6（C-5），49.8（C-16），32.8（C-15），30.5（C-14），17.9（C-6），13.4（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[12]，故鉴定化合物8为16R-E-isositsirikine.

化合物9黄色固体，C21H26N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.35（1H，s，1-NH），7.45（1H，d，J=7.7 Hz，H-9），7.29（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.12（1H，d，J=7.5 Hz，H-11），7.07（1H，t，J=7.4 Hz，H-10），5.53（1H，dt，J=18.3，9.6 Hz，H-19），5.21（1H，dd，J=17.3，1.9 Hz，H-18α），5.17（1H，dd，J=10.2，1.9 Hz，H-18β），3.93（1H，dd，J=11.1，7.3 Hz，H-17α），3.73（1H，dd，J=11.2，5.8 Hz，H-17β），3.63（3H，s，22-OMe）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：174.5（C-22），138.5（C-19），136.3（C-13），134.4（C-2），127.4（C-8），121.6（C-11），119.5（C-10），118.3（C-18），118.3（C-9），111.1（C-12），108.1（C-7），62.3（C-17），61.2（C-21），59.8（C-3），52.8（C-5），51.9（22-OMe），48.3（C-16），44.8（C-20），40.6（C-15），32.0（C-14），21.7（C-6）.以上数据与文献报道基本一致[13]，故鉴定化合物9为sitsirikine.

化合物10棕色固体，C21H28N2O3.1H NMR（600 MHz，MeOD）δ：7.40（1H，d，J=7.8 Hz，H-9），7.32（1H，d，J=8.1 Hz，H-12），7.07（1H，m，H-11），7.00（1H，m，H-10），4.07（1H，dd，J=10.8，8.5 Hz，H-17α），3.73（1H，dd，J=10.8，6.1 Hz，H-17β），3.67（3H，s，22-OMe），0.96（3H，t，J=7.5 Hz，H-18）；13C NMR（150 MHz，MeOD）δ：174.9（C-22），138.1（C-13），135.6（C-2），128.3（C-8），122.0（C-11），119.8（C-10），118.6（C-9），112.0（C-12），107.8（C-7），62.6（C-17），61.3（C-3），61.1（C-21），54.2（C-5），51.9（22-OMe），49.4（C-16），40.9（C-15），40.3（C-20），31.5（C-14），24.0（C-19），22.3（C-6），10.9（C-18）.以上波谱数据与文献报道基本一致[14]，故鉴定化合物10为19，20-dihydroisositsirikine.

化合物11棕色固体，C22H26N2O4.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.59（1H，s，H-12），7.42（1H，d，J=7.8 Hz，H-9），7.26（1H，s，H-17），7.22（1H，d，J=7.8 Hz，H-10），7.12（1H，t，J=7.4 Hz，H-11），4.99（1H，d，J=17.2 Hz，H-19），4.93（1H，d，J=11.2 Hz，H-18α），4.80（1H，s，H-18β），3.76（3H，s，17-OMe），3.62（3H，s，22-OMe）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：168.3（C-22），160.8（C-17），137.8（C-13），136.5（C-19），129.7（C-2），126.4（C-8），122.6（C-10），119.8（C-11），118.0（C-9），117.8（C-18），112.6（C-12），109.6（C-16），105.1（C-7），70.4（C-3），67.9（C-5），62.4（C-21），62.0（17-OMe），51.3（22-OMe），37.3（C-20），26.8（C-14），19.9（C-6）.以上数据与文献报道基本一致[15]，故鉴定化合物11为去氢毛钩藤碱N-氧化物.

化合物12棕色固体，C22H26N2O4.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.40（1H，s，H-9），7.25（1H，s，H-17），7.01（2H，m，H-10，H-11），4.76（1H，d，J=12.9 Hz，H-21α），4.50（1H，d，J=12.6 Hz，H-3），3.94（1H，d，J=12.9 Hz，H-21β），3.81（3H，s，17-OMe）），3.61（3H，s，22-OMe）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：167.7（C-22），159.8（C-17），137.2（C-13），130.8（C-2），130.1（C-20），129.8（C-19），126.1（C-8），121.8（C-11），119.3（C-10），118.0（C-9），112.0（C-12），110.7（C-16），76.7（C-21），72.0（C-3），62.0（17-OMe），61.2（C-5），51.3（22-OMe），33.2（C-14），32.7（C-15），18.0（C-6），13.3（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[16]，故鉴定化合物12为geissoschizine N-oxide methyl ether.

化合物13白色固体，C22H28N2O4.1H NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.56（1H，s，1-NH），7.47（1H，d，J=7.4 Hz，H-9），7.18（1H，t，J=7.6 Hz，H-11），7.06（1H，d，J=7.5 Hz，H-10），6.94（1H，d，J=7.7 Hz，H-12），3.61（3H，s，22-OMe），3.52（3H，s，17-OMe），2.79（1H，d，J=13.2 Hz，H-15），0.89（3H，t，J=7.3 Hz，H-18）；13C NMR（100 MHz，CDCl3）δ：182.7（C-2），169.2（C-21），160.4（C-17），140.5（C-13），134.5（C-8），127.3（C-11），124.8（C-9），122.2（C-10），111.6（C-16），109.7（C-12），73.1（C-3），61.1（17-OMe），57.4（C-7），54.6（C-21），53.9（C-5），51.2（22-OMe），40.2（C-20），38.9（C-15），34.8（C-6），25.4（C-14），19.3（C-19），12.9（C-18）.以上波谱数据与文献报道基本一致[17]，故鉴定化合物13为柯诺辛碱.

化合物14 淡黄色固体，C21H26N2O4.1H NMR（600 Hz，CDCl3）δ：7.45（1H，m，H-9），7.16（1H，t，J=7.6 Hz，H-11），7.03（1H，m，H-10），6.86（1H，d，J=7.3 Hz，H-12），3.71（3H，s，17-OMe），3.61（1H，s，H-5α），0.82（3H，s，H-18）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：182.1（C-2），171.6（C-22），159.7（C-17），140.3（C-13），134.2（C-8），127.6（C-11），125.4（C-9），123.4（C-10），112.5（C-16），109.4（C-12），72.5（C-3），61.3（17-OMe），58.3（C-21），56.3（C-7），54.4（C-5），38.3（C-15），35.7（C-6），29.5（C-14），24.4（C-19），11.5（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[18]，故鉴定化合物14为异钩藤酸.

化合物15淡黄色固体，C22H26N2O4.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：8.20（1H，s，1-NH），7.45（1H，d，J=7.4 Hz，H-9），7.17（1H，m，H-11），7.03（1H，t，J=7.6 Hz，H-10），6.85（1H，d，J=7.7 Hz，H-12），4.93（2H，m，H-18），3.68（3H，s，17-OMe），3.57（3H，s，22-OMe），3.29（1H，t，J=9.4 Hz，H-3），3.19（1H，dd，J=10.9，4.1 Hz，H-15）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：182.0（C-2），168.4（C-22），159.6（C-17），139.8（C-19，C-13），134.1（C-8），127.6（C-11），125.4（C-9），122.5（C-10），115.4（C-18），112.2（C-16），109.4（C-12），72.2（C-3），61.4（17-OMe），58.8（C-21），56.9（C-7），54.1（C-21），51.1（22-OMe），42.6（C-20），41.0（C-15），35.6（C-6），27.4（C-14）.以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物15为异柯诺辛因碱.

化合物16淡黄色固体，C22H28N2O4.1H NMR（600 MHz，MeOD）δ：7.41（1H，m，H-9），7.33（1H，s，H-17），7.18（1H，d，J=7.5 Hz，H-12），7.04（1H，t，J=7.1 Hz，H-11），6.88（1H，d，J=7.9 Hz，H-10），3.59（3H，s，22-OMe），3.53（3H，s，17-OMe），2.72（1H，dt，J=13.3，3.6 Hz，H-15），2.42（1H，d，J=8.8 Hz，H-3），0.88（3H，s，H-18）；13C NMR（150 MHz，MeOD）δ：181.0（C-2），170.7（C-22），162.1（C-17），135.9（C-8），128.6（C-11），125.7（C-9），123.2（C-10），112.4（C-16），110.5（C-12），74.6（C-3），61.7（17-OMe），58.8（C-7），55.8（C-5），54.9（C-21），51.6（22-OMe），41.8（C-20），40.5（C-15），35.7（C-6），26.7（C-14），20.5（C-19），13.2（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[20]，故鉴定化合物16为柯诺辛碱B.

化合物17棕色固体，C22H26N2O4.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.23（1H，s，H-17），7.19（1H，d，J=7.5 Hz，H-9），7.18（1H，t，J=7.6 Hz，H-11），7.04（1H，t，J=7.5 Hz，H-10），6.84（1H，d，J=7.6 Hz，H-12），5.50（1H，dt，J=17.8，11.8 Hz，H-19），4.95（1H，d，J=17.8 Hz，H-18a），4.90（1H，d，J=11.8 Hz，H-18b），3.73（3H，s，17-OMe），3.61（3H，s，22-OMe），3.39（1H，t，J=8.1 Hz，H-3），3.27（1H，dd，J=10.8，4.1 Hz，H-15）；13C NMR（150 MHz，CDCl3）δ：181.2（C-2），159.8（C-17），139.6（C-13，19），133.8（C-8），128.0（C-11），123.4（C-9），122.7（C-10），115.5（C-18），109.3（C-9），75.2（C-3），60.2（17-OMe），58.9（C-21），56.2（C-7），55.0（C-5），51.3（22-OMe），42.2（C-20），39.8（C-15），34.9（C-6），27.4（C-14）.以上数据与文献报道基本一致[19]，故鉴定化合物17为去氢钩藤碱.

化合物18棕色固体，C21H23N2O3.1H NMR（600 MHz，CDCl3）δ：7.55（1H，s，H-17），7.53（1H，d，J=7.3 Hz，H-9），7.46（1H，d，J=8.0 Hz，H-12），7.14（1H，t，J=7.5 Hz，H -11），7.08（1H，t，J=7.4 Hz，H-10），3.74（3H，s，17-OMe）1.26（3H，d，J=7.2 Hz，H-18）；13C NMR（151 MHz，CDCl3）δ：167.8（C-22），155.2（C-17），137.9（C-13），135.9（C-2），127.4（C-8），121.4（C-11），119.3（C-10），117.9（C-9），111.0（C-12），109.4（C-16），72.6（C-19），54.6（C-3），52.9（C-5），51.0（22-OMe），37.4（C-20），30.7（C-14），27.2（C-15），22.6（C-6），18.5（C-18）.以上数据与文献报道基本一致[21]，故鉴定化合物18为阿枯阿米精.

4 抗炎活性

研究表明，炎症小体作为炎症反应的中心环节，其与多数疾病密切相关，因此可成为治疗炎症性疾病的重要靶点，其中，与NLRP3炎症小体相关疾病较多，如痛风、糖尿病、类风湿关节炎等.钩藤虽具有息风定惊，清热平肝的功效，但近年来，对于钩藤中生物总碱的抗炎活性的研究较少，为了寻找其中具有抗炎活性的成分，对分离鉴定的部分生物碱进行了NLRP3炎症小体活性的初筛，NLRP3炎症小体激活会导致巨噬细胞中的LDH释放，通过对小鼠巨噬细胞J774A.1细胞中NLRP3炎症小体的抑制作用，筛选出钩藤生物碱中具有抗炎活性的化合物.实验中用Nigericin对NLRP3炎症小体进行激活，使用LDH分析试剂盒进行测试，测定了分离鉴定的生物碱在20μmol/L浓度下对细胞中LDH释放的抑制率.以MCC950（0.1μmol/L）为阳性对照，化合物的LDH释放率如表1所示.实验结果显示，除化合物13外，其余化合物对于抑制LDH释放反应抑制活性较差，释放率大多大于50%，几乎没有抗炎活性.其中，化合物13抑制LDH的释放率为29.9%，能在一定程度上抑制LDH的释放，表明该化合物可能具有一定抗炎活性.

表1 化合物对于J774A.1细胞中LDH释放率Tab.1 LDH release rate by some compounds in J774A.1 cells

5 讨论

本实验从钩藤带钩茎的茎叶中分离鉴定了18个生物碱，包括10个柯楠因型生物碱，2个柯楠因型N-氧化物，5个柯诺辛型生物碱，1个阿马里新型生物碱.化合物2，7，8和10首次在该植物中分离得到，丰富了钩藤生物碱成分.根据近年来相关文献报道，关于钩藤提取物的活性报道大多集中在神经退行疾病方面，其中，蓬籽嗪甲醚[22]和geissoschizine N-oxide methyl ether[23]具有非常不错的抑制乙酰胆碱酯酶活性，起到预防或治疗的目的.在抗炎活性中，化合物13可能抑制NLRP3炎症小体活化从而抑制细胞凋亡，但其具体信号通路机制仍需探索，其余化合物的抗炎活性较弱，因此，化合物13有可能成为治疗免疫和炎症相关疾病的候选药物.