星形胶质细胞连接蛋白在阿尔茨海默病中的作用研究进展

涂娜，黄小敏，刘凤玲，苏一洵，易陈菊

1 星形胶质细胞连接蛋白的表达和功能

在中枢神经系统中，神经元接收、整合、组织和传递信息需与胶质细胞尤其是星形胶质细胞相互作用才能充分发挥功能。星型胶质细胞组成细胞网络，向神经元提供营养和代谢支持[1]。星形胶质细胞之间的通信通过缝隙连接（gap junction，GJ)来实现。连接蛋白（connexin，Cx）在细胞膜形成六聚体组成连接子；位于相邻细胞膜表面的两个连接子组成缝隙连接通道（gap junction channel，GJC），继而大量GJC聚集形成GJ。连接子也可以作为半通道（hemichannel，HC）开放，介导胞内外小分子物质交换。另外，泛连接蛋白（pannexin，Panx）也可形成HC[2]。

Cx由4个α-螺旋跨膜结构域和2段胞外环连接而成[2]，在大脑所有类型的细胞中表达[1,3,4]，但不同的细胞类型表达不同的Cx，且表达水平不同。已知星型胶质细胞Cx的表达量最高，其中又以Cx43和Cx30表达量最多，而小胶质细胞则以Cx43、Cx32和Panx1为主[4,5]。同时，在胶质细胞活化过程中其表达水平也会发生变化[6]。在炎症反应等病理条件下，Cx可作为HC被激活开放，介导细胞内和细胞外的小分子交换[7,8,9]。Panx是编码3种膜蛋白Panx1、Panx2、Panx3的基因家族[2,6]，虽与Cx有相似的膜拓扑结构，但二者之间并无同源性。迄今的研究表明，仅在少数病例中发现Panx在胶质细胞表达[9,10]。然而，胶质细胞中Panx HC一旦被激活，就会参与介导胶质递质如ATP和谷氨酸及趋化因子的释放，从而造成神经元功能损伤。这在阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）[11]、自身免疫性脑脊髓炎[12]、肌萎缩侧索硬化[13]和神经性疼痛[14]小鼠模型中都有相应的报道。

2 星形胶质细胞Cx在AD中表达的变化

AD以进行性近记忆力下降，精神行为异常和人格改变为特征，是变性病性痴呆的主要类型[15]。其病理学的显著特征之一是大脑皮质和海马的星形胶质细胞活化[16,17]，但目前对星形胶质细胞在AD中的作用尚缺乏系统性的认识。

在AD患者的脑组织切片中发现，Cx43和Cx30呈斑点状密集分布于Aβ斑块周围的星型胶质细胞中[18]。此外，在大于4月龄的APPswe/PS1dE9（APP/PS1）小鼠的大脑皮质和海马区，Cx43和Cx30的免疫反应性随Aβ沉积增加而增强。半定量分析表明，当存在大量的Aβ斑块时，Cx表达上调。而位于新生成的Aβ斑块附近的Cx则表达降低。由于Aβ斑块随着疾病的发展而积累，所以新生斑块的比例在淀粉样病变后期大幅降低[19]。因此在AD中后期，Cx的总量升高。这一结果也在AD患者的大脑标本中被证实[19]。

然而，体外培养的星形胶质细胞受促炎因子（如IL-1β、TNF-α）刺激后，Cx43表达降低[20]，这与体内研究结果相矛盾，可能是因为体内斑块周围的炎症网络比体外要复杂得多。并且，体外培养星型胶质细胞Cx的表达是在促炎因子短期（24～48 h）刺激后发生变化；而体内实验中，细胞因子受体因受到长期的刺激而灵敏度降低并导致参与调节Cx表达和相关通道功能的某些内部信号网络解耦连。已有研究表明，此过程是通过TNF-α信号通路途径发生的；在AD患者和小鼠模型的海马区，蛋白质DENN/MADD（TNF受体-1的胞内介质）的下调支持了这一论点[21,22]。

3 APPswe/PS1dE9中星形胶质细胞Cx的通道功能

星形胶质细胞的Cx既可以作为GJ又可以作为HC发挥作用。在体内的病理条件下，星形胶质细胞通过GJ介导的星形胶质细胞网络向远处传递信号的功能保持不变或增强[23,24]。我们最近的研究利用一种可通过GJ的星形胶质细胞选择性摄取的小分子染料SR101（sulforhodamie 101），在9月龄APP/PS1和同龄野生型小鼠的活体脑切片中进行FRAP（Fluorescence recovery after photobleaching）实验以检测成年小鼠胶质细胞GJ活性[25]。结果发现在海马区星形胶质细胞中，APP/PS1小鼠荧光恢复与野生型相同；当加入GJ阻断剂甘珀酸后，APP/PS1小鼠和同龄野生型小鼠中均有40%的荧光恢复被抑制。这表明GJ功能在APP/PS1小鼠中保持不变且不受星形胶质细胞活化的影响[25]。

在体外进行溴化乙锭（Ethidium bromide，EtBr）摄入实验发现，Aβ25-35处理可分别导致星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元中HC激活。其中，对Aβ最敏感的是小胶质细胞，其次是星形胶质细胞，最后是神经元。通过利用抑制剂与小鼠敲除模型发现，在小胶质细胞中，Cx43和Panx1 HC会被Aβ25-35激活；而在星形胶质细胞中，主要是Cx43 HC被激活[7,12,26]。

在最近的研究中，我们通过EtBr摄入实验在9月龄的APP/PS1小鼠活体脑切片中检测到星形胶质细胞HC被激活[27]。并发现星型胶质细胞与Aβ斑块的距离不同时，其表型有所不同。根据与Aβ斑块的接近程度，我们将星形胶质细胞分为“近”和“远”2个不同的群体。“近”星形胶质细胞是指细胞直接接触斑块，并且GFAP信号增强；而“远”星形胶质细胞则远离斑块（定义为＞50μm），且胶质细胞形态处于未活化状态。在不含有Aβ斑块（包括野生型小鼠和年轻的APP/PS1小鼠）中，EtBr荧光信号相对较弱，且不能被HC阻断剂甘珀酸抑制，说明这些胶质细胞HC未开放。而在有大量Aβ斑块的年老APP/PS1小鼠中，胶质细胞内的EtBr信号明显上调，并且这种现象在“近”星形胶质细胞中最为显著。当用甘珀酸干预时，信号则降低至野生型小鼠组水平，说明此时星形胶质细胞的HC被激活，并且“近”组星型胶质细胞的HC激活开放的程度高于“远”组[28]。

有趣的是，虽然星形胶质细胞高表达Cx43和Cx30，但是我们的研究发现只有Cx43参与了APP/PS1小鼠的星形胶质细胞HC激活，Cx30并未参与。这已经通过使用特异性敲除星形胶质细胞Cx43或全身性敲除Cx30的APP/PS1小鼠进行EtBr摄入实验得到证实[29]。当星形胶质细胞Cx43被敲除时，“远”星形胶质细胞的EtBr信号会消失，“近”星形胶质细胞还剩下少部分的EtBr信号，证明主要是Cx43 HC被激活；同时，该少部分EtBr信号可被Panx1 HC特异性阻断剂完全阻断，表明“近”胶质细胞的HC激活开放也可以通过Panx1 HC介导。简言之，在APP/PS1小鼠的海马区，“远”和“近”星形胶质细胞Cx43 HC均被激活，但Panx1 HC仅在“近”胶质细胞中有开放，且激活程度明显低于Cx43 HC。我们进一步的研究结果表明，在APP/PS1小鼠中，星形胶质细胞Cx43 HC激活的主要原因是细胞内的高浓度[Ca2+]i。与此相反，体外实验培养的细胞或活体脑切片中胶质细胞的Cx43 HC则主要被促炎症信号激活。

4 APP/PS1中的星形胶质细胞Cx/Panx半通道开放造成神经元功能损伤

在AD小鼠模型APP/PS1中，星型胶质细胞HC激活后对疾病的发展起什么作用和影响？如上所述，星型胶质细胞的高[Ca2+]i触发Cx43 HC开放。而胞外的Ca2+再通过开放的HC进入胞内使[Ca2+]i维持在高浓度状态，从而形成恶性循环。同时，Cx43 HC的慢性激活导致谷氨酸的释放[7,30]。ATP同样通过Cx HC和Panx HC释放[31,32]。在AD中，通过HC释放的ATP可作用于星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元。例如，ATP可直接作用于神经元嘌呤受体，并且导致神经元细胞内Ca2+超载，导致神经元损伤和神经性营养不良[33]。最近的研究也表明，在神经元中，ATP也可触发Panx1 HC开放使Ca2+内流，进而导致神经元死亡[34]。此外，ATP转化为腺苷后可调节突触活性发生突触抑制[35,36]，从而参与AD中的突触损伤，进而导致结构性神经炎病变[33]。但ATP转化为腺苷也可能对神经元起到保护作用[37]。

在APP/PS1小鼠中，星形胶质细胞HC的慢性激活使[Ca2+]i维持较高浓度水平，进而导致胶质递质持续释放，这表明星形胶质细胞可作为毒性效应的放大器参与神经退行性病变。为了解AD中神经元的损伤和病变程度，我们用RTN3（reticulon-3）抗体标记小鼠脑切片中营养不良性神经突[38]。在APP/PS1-Cx43KO和对照APP/PS1小鼠的Aβ斑块附近，均检测到RTN3阳性的神经突；但是APP/PS1-Cx43KO小鼠中的RTN3阳性的神经突数量相比同龄的对照APP/PS1小鼠显著降低。其次，APP/PS1-Cx43KO小鼠的海马区神经元中超氧化物水平相比对照明显降低[39]。这表明，当Cx43 HC被阻断时，神经元损伤明显减轻。阻断Cx43 HC可以一定程度上减缓AD的病理进程。

鉴于星型胶质细胞HC在AD病程中的重要作用，HC可能成为治疗AD的潜在靶点。目前已知可以使用药物抑制剂、抗体或模拟肽等阻断星形胶质细胞HC开放。研究显示，CBX和甘草酸等药物抑制剂都能有效地抑制HC开放。但这些药物往往也会影响星形胶质细胞的GJ功能，而GJ功能对维持星形胶质细胞网络的稳态和代谢功能有重要的作用。所以最理想的是使用能阻断HC但不改变GJ功能的药物。如Cx特异性抗体或Panx模拟多肽可选择性阻断HC的通透性[40]。据报道，Cx43模拟肽Gap19可以在不改变GJ的情况下，抑制原代培养和活体海马脑片中星形胶质细胞的HC[41]。此外，我们选择了一种从智利的boldo植物中提取的生物碱boldine。boldine能阻断体外培养系膜细胞的HC[42]，可穿过血脑屏障，无药物毒性作用，并且可以口服。我们的研究结果表明，boldine不仅可以像CBX一样阻断星形胶质细胞和小胶质细胞的HC，同时不影响星形胶质细胞的GJ功能。APP/PS1小鼠长期口服boldine，可以阻断星形胶质细胞HC开放，减少胶质递质如谷氨酸和ATP的释放，降低星形胶质细胞[Ca2+]i水平，从而减轻神经元损伤，起到减缓AD疾病进程的作用[43]。

5 总结与展望

胶质细胞活化为AD等神经退行性疾病的标志性特征之一。在AD中，活化的胶质细胞（包括星型胶质细胞和小胶质细胞）围绕在Aβ斑块周围[44]。星型胶质细胞的功能变化与Cx紧密相关。最近的研究通过使用AD小鼠模型进一步揭示了AD中星型胶质细胞Cx的表达和功能变化影响了整个疾病的病理进程。

在生理状态下，星形胶质细胞的GJ维持着较高水平。AD小鼠的星形胶质细胞GJ增强或者维持较高水平，增加多种小分子物质的扩散。一方面，大脑皮质中星形胶质细胞的GJ参与了胞内Ca2+波的传播，调控了K+稳态维持、胞内代谢物质传播、胶质递质传递、血流控制及神经元与胶质细胞之间的相互作用。另一方面，AD中星形胶质细胞的GJ增强可促进葡萄糖代谢。GJ通过提供能量代谢物和稀释谷氨酸等有毒物质，减轻神经损伤[23]。但由于目前没有针对GJ或HC的特异性阻断剂，很难直接界定胶质细胞GJ在疾病中有益还是有害[45]。利用Cx基因敲除小鼠并不能直接解决这个问题，因为在这些小鼠中两种通道的功能都受到影响[45]。与GJ相比，HC在神经元功能损伤中似乎发挥着更重要的作用[28,46,47]。因此，目前亟需研发一种能选择性靶向胶质细胞或神经元的Cx和Panx，特异性区分GJ和HC的新药物。靶向胶质细胞逐渐成为神经退行性病变的一种替代治疗方法[48-50]，胶质细胞Cx可成为潜在靶点。对星形胶质细胞Cx的综合性研究可更好地理解神经退行性疾病的发病机制和病理过程，具有非常重要的意义。