脯氨酸羟化酶2在消化系统恶性肿瘤中的研究进展

滕霞丽，周 晶，周慧玲综述，于 鸿审校

0 引 言

脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)是位于细胞内的一种双加氧酶的氧传感器蛋白，其作用是直接感受氧分压的变化，并根据氧分压发挥活性。常氧状态下，PHD在氧依赖性降解结构域上羟基化缺氧诱导因子(hypoxia- inducible factor,HIF)的两个脯氨酸残基(pro402和pro564)，被羟化的HIF与VHL(von hippel-lindau)肿瘤抑制蛋白结合，然后在蛋白酶体内被降解；然而，缺氧状态下PHD依赖氧的羟基化作用是有限的，未被降解的HIF表达水平升高并迅速稳定，进一步参与细胞低氧适应性调节[1-2]。在哺乳动物细胞中，发现了脯氨酸羟化酶的3种亚型，包括PHD1、PHD2和PHD3，其中PHD2被认为是调节低氧反应的关键酶[3]。Semenza[4]研究证实HIF的表达与肿瘤的形成、转移和不良预后密切相关，但目前关于PHD2在肿瘤中的作用机制尚不明确。PHD2最初作用是细胞的氧传感器，其许多功能通过HIF通路表达，然而最近的研究发现PHD2在肿瘤中显示出与HIF和羟化酶无关的功能，并调控不同的细胞通路[5]。近年来PHD2作为调节HIF的重要蛋白之一已成为国内外备受瞩目的研究热点，但其在恶性肿瘤进展中的作用仍备受争议，研究表明PHD2在不同恶性肿瘤中的作用不尽相同，甚至在同种恶性肿瘤中也可通过不同机制发挥截然相反的作用[6-9]。PHD2逐步成为许多疾病研究的重点，但在消化系统恶性肿瘤中的研究甚少，查阅相关文献发现，尚缺乏PHD2与食管癌、胆囊癌及壶腹部癌等消化系统恶性肿瘤的相关研究，因此本文仅就PHD2在胃癌、肝癌、胰腺癌及结直肠癌中的最新研究结果作一简要综述。

1 PHD2的基本特征

PHD2属于亚铁离子和2-酮戊二酸双加氧酶超家族的一员，是一个四聚体，由两个羟化酶单位和两个蛋白二硫化物异构酶亚单位构成，广泛分布于上皮来源的正常组织，主要在细胞质表达[10]。哺乳动物的PHD2 具有独特的催化结构-N末端锌指结构，但在PHD1、PHD3中不存在此结构[11]。PHD2的酶作用需要分子氧作为协同底物，其中一个氧原子加载到HIF的氧依赖性降解结构域的 Pro402 或 Pro564 形成脯氨酸残基，另一个氧原子则与 2-酮戊二酸发生去碳羧基反应，生成延胡索酸和二氧化碳。此外，PHD2 羟基化HIF的反应需要铁和维生素C的参与[12]。PHD 1～3 均能使HIF氧依赖性降解结构域的脯氨酸残基发生羟基化反应，在此过程中PHD2发挥着主要作用( PHD2>PHD3>PHD1)[13]。

2 PHD2与HIF的关系

HIF是实体肿瘤生长所必需的，现已被证实在多种恶性肿瘤(如乳腺癌、食管癌和脑癌等)的发生、发展和转移过程中发挥关键作用,并且HIF过表达是几乎所有恶性肿瘤预后较差的一个预测指标[14]。研究显示，在多种恶性肿瘤中发现VHL基因的突变或缺失，有研究证明了VHL肿瘤抑制基因在常氧状态下通过脯氨酸羟基化途径对HIF进行降解[15]。常氧条件下，PHD2在氧分子的协同作用下，使HIF发生羟基化反应，羟基化的 HIF可被VHL蛋白识别并在蛋白酶体内降解；而在缺氧条件下，PHD2不能被活化，HIF氧依赖的特定降解结构域未被羟基化，导致VHL蛋白不能够识别HIF，此通路中的HIF不仅没被降解，其活性反而增加，在其他相关因子介导下，进一步促进具有缺氧反应元件结构域的靶基因发生转录[16]。依据此机制，几种能够阻止VHL与HIF结合的HIF-PHD抑制剂也已被开发出来，期待用于能从HIF信号通路获益疾病(如促进肾源性贫血的内源性EPO生成)的临床治疗[17]。 Henze等[18]在人脑胶质细胞瘤中发现PHD作为一种反馈生存机制，通过控制HIF水平来保护肿瘤细胞免受缺氧诱导的细胞死亡，并强调了HIF与PHD之间相互作用的复杂性。这些研究表明HIF-PHD调节轴在肿瘤进展中的作用不可忽视，然而目前关于PHD在肿瘤发生中的具体作用仍研究甚少。

3 PHD2与肿瘤血管生成的关系

肿瘤血管生成是由两个互补过程调节的，通过局部发芽和骨髓循环来源细胞(bone marrow derived dendritic cells,BMDC)诱导新生血管形成这两种途径促进实体肿瘤血管的快速生长。血管生成起始部分是由转录因子家族HIF介导的，虽然PHD2最初被认为是HIF蛋白稳定性的负调节因子，但是关于PHD2在肿瘤血管生成中的确切作用有着相互矛盾的研究结果，这种分歧似乎是由基质衍生的PHD2所引起，特别是由于内皮细胞和肿瘤细胞衍生的PHD2的参与[19]。

Chan等[20-21]研究发现，在PHD2表达降低的肿瘤中ANG和IL-8释放增加，而这两种因子在血管生成和BMDC动员中发挥促血管生成的作用，还发现敲除PHD2基因可提高常氧状态下NF-kB的活性，从而增加IL-8和ANG的活性，促进肿瘤血液供应，进而促进肿瘤生长。以上研究提示PHD2通过限制ANG和IL-8的表达来发挥肿瘤抑制因子的作用，同时NF-kB是在PHD2沉默时增强血管生成所必需的，且NF-kB反过来调节ANG和IL-8，表明PHD2对肿瘤血管的影响是通过NF-kB在ANG和IL-8上的活性介导的，而不受HIF的调控。但是对于PHD2限制IL-8和ANG释放的具体机制，以及BMDC如何招募到肿瘤细胞及其对肿瘤脉管系统的作用却了解甚少。与此相反，Mazzone等[22]在小鼠胰腺癌模型中研究了PHD2在肿瘤发展中的基质作用，发现野生型小鼠(Phd2+/+)肿瘤的生长比杂合子小鼠(Phd2+/-)更具有侵袭性和转移性，进一步研究发现肿瘤基质中的PHD2有调节血管正常化的功能，使细胞更紧密的连接并防止转移扩散。当然这两种分歧有可能是实验模型的不同而造成的，使用自发肿瘤模型以及各种细胞类型的特异性敲除，可能有助于阐明PHD2对肿瘤血管生成的作用。

4 PHD2与消化系统恶性肿瘤的关系

4.1 PHD2与胃癌胃癌是目前最常见的消化道恶性肿瘤之一，近年来早期胃癌得益于内镜技术的发展，可以获得较好的疗效，但进展期胃癌的致死率依然很高，因此广泛深入研究胃癌发病的分子机制，寻求其分子分型、特异性标志物以及治疗靶点是有效防治胃癌、改善其预后的关键。研究表明传统的预后指标(特别是肿瘤分期和淋巴结转移状况等)对胃癌患者的生存显示出一定的预测价值，但其作用在临床实践中依然是有限的。最近越来越多关于肿瘤标志物的研究集中在癌细胞中酶的表达上，这些酶除了作为生物标志物的用途外，也可能是新疗法的潜在靶点[23]。Kamphues等[24]通过对121例胃癌患者 PHD2 表达分析，发现PHD2在正常胃腺体呈局灶性弱至中度细胞质着色，而在肿瘤细胞细胞质中高表达，且在多因素分析中，PHD2被证明是患者生存的独立预后因素，这一研究结果使细胞质中PHD2的表达可作为胃腺癌预后的可靠标志物；此外，PHD2的表达与Lauren分型中肿瘤的生长模式有很强的相关性，研究显示肠型肿瘤比弥漫型或混合型肿瘤更有可能高表达PHD2。简立辉[25]研究发现在促纤维反应越明显的胃癌中，PHD2阳性表达率越低，提示在相似的肿瘤演进背景下，PHD2具有抑制癌性促纤维反应的作用。除此之外，Brökers等[26]报道，PHD2不仅影响胃癌的生长模式，而且PHD2抑制可能导致化疗耐药性增加。总之，上述研究表明PHD2的表达是胃腺癌的一个重要的预后生物标志物，可能有助于识别高危患者，且PHD2可能是胃癌患者化疗的潜在靶点之一。

4.2PHD2与肝癌肝细胞肝癌是肝癌最常见的组织学类型，在大约80%的病例中，肝细胞肝癌的进展过程与肝硬化、纤维化以及炎症和氧化应激有关，因此，在缺氧应激相关通路寻找肝细胞肝癌可能的治疗靶点已成为肝癌研究热点之一。Zhen等[27]观察了220例肝细胞肝癌患者的肿瘤细胞中PHD2的表达情况，并随访其无病生存率(disease free survival, DFS)和总体生存率(overall survival, OS)，发现与PHD2表达较高的患者相比，PHD2表达较低的患者DFS和OS均较高，且PHD2的高表达与较高的肿瘤分期( III 期和 IV期)、较大肿瘤直径(>5 cm)和较差的肿瘤分化程度以及较高的血浆AFP显著相关。与此同时，Guo等[28]也报道了在肝癌组织和肝癌细胞系中，PHD2的表达与癌旁非肿瘤组织和正常肝细胞系相比均上调，这些研究表明PHD2 过表达能够促进肝癌细胞的增殖和侵袭。进一步研究发现PHD2过表达上调了RAS和Raf的表达，并诱导了MEK、ERK、JAK1和STAT3的磷酸化，表明PHD2可能通过RAS/Raf/MEK/ERK和JAK1/STAT3途径促进肝细胞肝癌的发展。李震等[29]提出PHD2促进肝细胞肝癌进展的作用可能是通过抑制TGF-β1-Smad信号通路中的p-Smad2/3表达，进而上调癌基因c-Myc的表达来实现的。与此相反，Tao等[30]发现PHD2在人肝癌细胞系中的过度表达抑制了肿瘤细胞增殖，而敲除PHD2则发现肿瘤细胞增殖加快，提示PHD2表达水平与细胞增殖率呈明显的反比关系；进一步的研究发现PHD2介导的抑制细胞增殖是将细胞周期阻滞在G1/S转变期，细胞周期阻滞作用是由细胞周期蛋白D1负调控的，该通路依赖于PHD2的羟化酶活性，此外，在小鼠移植瘤生长实验中，观察到PHD2过表达与多西环素治疗相结合比单独PHD2过表达，或仅使用多西环素治疗具有更强的肿瘤抑制作用，这表明高PHD2水平可能增强多西环素治疗的细胞毒性作用。因此，值得进一步探讨PHD2表达水平是否在各种肝脏治疗方案中发挥治疗或预后作用。

4.3PHD2与胰腺癌胰腺癌是常见的消化系统恶性肿瘤，由于胰腺癌起病隐匿、侵袭性强、缺乏有效早期影像学诊断方法，大多数患者在确诊时肿瘤已经无法全部切除或出现远处转移，错过了手术治疗的最佳时机，因此寻找新的诊断和治疗方法迫在眉睫[31]。大量研究表明,HIF在胰腺癌的发生发展、浸润转移、药物抵抗及预后等方面发挥重要作用[32]。PHD2是HIF的关键调节因子，有望成为潜在的治疗靶点。Su等[33]研究发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌组织中PHD2 mRNA水平明显降低，且分化程度越差的癌组织中PHD2表达降低越显著，进一步研究发现PHD2在胰腺癌中通过抑制细胞周期蛋白D1表达来发挥抑癌作用的，但该通路不受HIF的介导；Su等在小鼠异种肿瘤抑制模型中观察到PHD2过表达是通过降低血管密度来减缓肿瘤生长的。与此不同的是，Gossage等[34]却发现与正常胰腺组织相比，胰腺癌中PHD2表达明显升高，且PHD2表达缺失与周围神经浸润存在显著相关性，但却未发现PHD2表达水平与其他临床病理变量之间的关联。Couvelard等[35]对胰腺内分泌肿瘤的研究表明，PHD2在胰腺内分泌癌中过表达且发现细胞核中PHD2的高表达与肿瘤侵袭性以及更高的复发率和致死率有关，此研究结果与Jokilehto等[36]在头颈部鳞状细胞癌中的发现相一致，研究发现头颈部鳞状细胞癌中PHD2的高表达和核转移与肿瘤分化较差和增殖较强明显相关。这些研究结果表明PHD2在胰腺癌发生中的潜在重要作用，但是具体机制尚不清楚。

4.4PHD2与结直肠癌以往的研究表明PHD在结直肠癌中发挥肿瘤抑制因子的作用，但其临床和预后意义尚不确定。研究发现结直肠癌中PHD的作用机制极为复杂，Erez等[37]提出PHD1是通过促进肿瘤坏死和降低微血管密度来抑制肿瘤的生长，Xue等[38]发现PHD3低表达可以增强肿瘤细胞的活力，从而促进结直肠癌的发生，而Chan等[39]的一组研究则表明PHD2是通过减少血管生成来抑制肿瘤生长的。在这3种亚型中，PHD2似乎在结直肠癌的发生发展中发挥着更为重要的作用。Chan等[39]检测结直肠癌组织中PHD2的mRNA 和蛋白表达水平与正常结肠组织表达水平相比均下降，这表明PHD2在结直肠癌中呈低表达。 Xie等[40]也发现在结直肠癌中，PHD2在癌组织中的表达水平明显下调，且生存分析表明PHD2低表达的早期结直肠癌患者预后显著差于高表达患者，因此PHD2可作为早期结直肠癌患者的预后指标。此外，已知PHD2的功能是在常氧条件下维持HIF的低水平，则PHD2的表达与肿瘤缺氧区域的HIF的表达成反比，但Dang等[41]使用结肠癌HCT116细胞发现同时敲除HIF和PHD2的肿瘤细胞比只敲除HIF的肿瘤细胞长的快，这一发现表明PHD2具有独立于HIF调节肿瘤生成的功能。这些发现仍需要在更深入的研究中进一步验证。

5 结 语

综上所述，PHD2是消化系统恶性肿瘤发生及进展过程中许多重要信号通路的中间环节，对肿瘤的增殖、侵袭、转移、凋亡及血管形成均有着重要的影响。一方面，PHD2在消化系统恶性肿瘤(如胃癌、胰腺癌和结直肠癌)中均表现出强烈的抑癌效应及与生存预后的显著相关性，因此它有望成为新型预后标志物；另一方面，我们必须清楚，肿瘤的发生发展不是单因素的，虽然PHD2被认为是调节低氧反应的关键酶，其可以通过降解HIF发挥抑癌作用，但也有可能通过其他途径促进肿瘤细胞增殖，增强其侵袭和转移的能力，从而导致肿瘤的恶性进展，因此深入研究PHD2的功能对于理解PHD2在肿瘤进展中的作用至关重要；此外，随着相关基础研究和临床试验的顺利进行，PHD2的靶向调控有望开辟肿瘤的新型治疗方法。PHD2有望在消化系统恶性肿瘤的预测、诊断和靶向治疗中体现出重要的价值。