泰山白首乌内生真菌多样性及其抗肿瘤活性研究

冯坤苗，吴思佳，陈文华，代 威，徐凌川，韩 婷 （. 海军军医大学药学院, 上海 004；. 浙江中医药大学药学院, 浙江 杭州 005；. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 5099）

泰山白首乌来源于为萝摩科（Asclepiadaceae）鹅绒藤属（CynanchumLinn.）植物戟叶牛皮消Cynanchum bungeiDecne. 的干燥块根，《本草备要》记载：“具有养血补血、补肝肾、强筋骨和润肠通便的作用”，也被誉为泰山四大名药之首[1-2]。研究表明，泰山白首乌的主要活性成分为苯乙酮和C21甾体皂苷[3-7]。泰山白首乌的主要药理活性有抗肿瘤、保肝、抗炎、抗菌、抗病毒、抗抑郁、降血糖 等[5-7]。

植物内生菌是一类广泛存在于宿主植物体内，且不引起宿主明显病症的真菌，是一类具有丰富多样性的微生物类群。植物内生菌通过“协同进化”作用，以促进宿主植物生长，增强抗逆性，促进药用植物中有效成分的积累[8-9]，植物内生菌已成为国内外学者的研究热点。顾晓洁等[10]2018 年报道了滨海白首乌块根中内生细菌的分离鉴定。Li 等[11]从滨海白首乌中分离出的一株产红色素具有抗氧化作用的内生真菌Stemphylium lycopersici。Gu 等[12]从滨海白首乌中分离得到的内生真菌Plectosphaerella cucumerinaYCTA2Z1 中分离鉴定得到13 种化合物，分离得到与宿主滨海白首乌相同的次级代谢产物单体告达庭（caudatin）、白首乌二苯酮、cynandione B 和 2',5'-二羟基苯乙酮[11-12]。但是，目前没有关于泰山白首乌内生真菌的传统分离纯化培养报道。同时，有研究表明，泰山白首乌的粗提物和单体化合物对多种肿瘤细胞株均具有显著活性[6]，目前已有从植物中分离得到具有抗肿瘤活性的内生真菌[13-14]的研究，但对泰山白首乌内生真菌的相关分离鉴定、活性成分及抗肿瘤等生物活性的研究还未开展。

本实验以泰山白首乌内生真菌为研究对象，通过传统分离培养法，将分离鉴定得到的泰山白首乌内生真菌进行液体发酵，并进行抗肿瘤活性菌株筛选。一方面探讨泰山白首乌内生真菌能否产生与宿主相似的次级代谢产物，另一方面为研发新的抗肿瘤活性药物提供科学依据。

1 材料

1.1 药用植物

3 个产地的健康泰山白首乌植株各5 株，包含根、茎、叶。济南的泰山白首乌叶（JTY）、泰山白首乌茎（JTJ）、泰山白首乌根（JTG），均采自山东中医药大学长清校区植物园内（36°56′ N, 116°79′ E）；临沂的泰山白首乌叶（LTY）、泰山白首乌茎（LTJ）、泰山白首乌根（LTG），均采自临沂费县御华景宸农业生态园内（35°27′ N, 117°97′ E）；泰安的泰山白首乌叶（TTY）、泰山白首乌茎（TTJ）、泰山白首乌根（TTG），均采自泰山（35°78′ N, 117°45′ E）。植物样品经山东中医药大学中药鉴定教研室徐凌川教授鉴定为泰山白首乌C. bungeiDecne.。采集的样品用无菌塑料袋包装，置于4 ℃冰箱保存备用，48 h 内进行样品处理。

1.2 仪器与试剂

T100™梯度PCR 扩增仪（美国BIO-RAD 伯乐T100 梯度PCR 仪）；电泳仪（上海天能科技有限公司）；凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；Qubit® 2.0 荧光计（赛默飞Invitrogen）；SW-CJ-1D 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；E.Z.N.A.真菌DNA 提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek）；Taq DNA Polymerase（ 赛默飞 Thermo） ； Agencourt AMPure XP（Beckman）；2×Trans Taq High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix I（北京全式金生物技术有限公司）；ddH2O（北京全式金生物技术有限公司）；琼脂糖（超纯）（北京天根生物科技有限公司）；50×TAE 缓冲液（北京索莱宝科技有限公司Solarbio）；DNA Maker（日本TaKaRa）；Goldview 核酸染料（10 000×）；6×Loading buffer（日本TaKaRa）；XD-101 CO2细胞培养箱（日本SANYO 公司）；奥林巴斯IX51 倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司OLYMPUS） ； ELX800 光吸收酶标仪（ 美国BioTek）；细胞培养瓶（美国FALCON）；青、链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；PBS（北京索莱宝科技有限公司）；RPMI-1 640（美国GIBCO）；DMEM（美国GIBCO）；L15（美国GIBCO）；FBS（美国ExCell Biology FBS500）；MTT（美国Amresco）；DMSO（溶解受试药品）（美国SIGMA D2650）；土豆（沃尔玛）；葡萄糖（源叶生物）；琼脂粉（源叶生物）；无水乙醇，分析纯（上海泰坦）；次氯酸钠（分析纯，国药集团）。

1.3 供试肿瘤菌株

人肝癌细胞HEPG2、人胃癌细胞HGC27、人结肠癌细胞HT-29、人宫颈癌细胞HELA（中国科学院上海细胞库）。

2 方法

2.1 分离鉴定

2.1.1 传统分离培养

表面消毒：将采集新鲜济南、临沂和泰安产的戟叶牛皮消的根、茎和叶用自来水冲洗干净，转移至超净台，进行“75%乙醇-2.5%次氯酸钠-75%乙醇”的3 步表面消毒处理。处理过后继续用无菌水冲洗5 遍，灭菌滤纸将表面水分吸干。

组织块培养：超净台中操作，用消毒的剪刀和镊子分别将根、茎与叶剪切成小的组织块（0.5 cm×0.5 cm），分别从3 个部位中各随机挑取20 个组织块，每组设置4～5 个组织块，分组好的组织块置于含有青霉素（50 mg/L）马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）的平板中，于温度25 ℃，湿度80%的恒温恒湿培养箱中进行内生真菌菌丝的生长情况的定期观察。挑取尖端菌丝转移到新的PDA 培养基中培养，至菌丝形态单一，即得到纯化的菌株[15-16]。根据内生真菌菌株的培养的形态特征初步划分为不同的形态型，拍照留存。根据菌株群落的培养特征，划分为不同的形态型，继续将分离纯化后的菌株接种至PDA 固体试管斜面培养基上进行培养，4 ℃冰箱保存。

2.1.2 内生菌鉴定

观察培养的内生真菌菌落形态，对照《真菌鉴定手册》进行形态学特征鉴定。将“2.1.1”项下形态一致的泰山白首乌内生真菌菌株进行合并[16]，参考E.Z.N.A.真菌DNA 提取试剂盒说明书提取菌株DNA。以提取的DNA 为模板，采用真菌ITS 通用引物TIS4（5’-TCC TCC GCT TTA TTG ATA TGC-3’）和ITS5（5’-GGA AGT AAA GTC GTA ACA AGG-3’）对菌株的r DNA-ITS 区域进行PCR 扩增。PCR 反应体系：2×Trans Taq Fidelity(HiFi) PCR SuperMix 15 μl，Primer（10 μmol/L）各1 μl，Genomic DNA 10 ng；补充双蒸水至 30 μl。反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性40 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，35 个循环，72 ℃延伸10 min。5 μl PCR 产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将合格的PCR 扩增产物送上海生工生物有限公司进行测序。内生真菌菌株测序得到的ITS 序列去除载体序列，利用NCBI 数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST 进行比对，根据所得分子鉴定结果并结合形态学特征确定菌株。

2.2 代谢产物抗肿瘤活性

2.2.1 代谢产物的提取

按“2.1”项下方法分离得到的90 个形态型泰山白首乌内生真菌菌株为供试菌株，PDA 固体培养基中接种活化。待菌丝覆盖培养基表面时，用直径5 mm 打孔器制备10 个菌饼，放入装有100 ml的PDA 培养基的锥形瓶中，每个菌种接种6 瓶。接种后于25 °C、180 r/min 振荡培养7 d。发酵完成后，抽滤并收集发酵培养液，1∶1 乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相，减压浓缩，即得乙酸乙酯提取物[17]。干燥后于4 °C 冰箱中避光保存。

2.2.2 抗肿瘤活性测试

二甲基亚砜(DMSO)溶解乙酸乙酯粗提物后，用PBS 分别稀释至0.001、0.01、0.1、1.0、10.0、100.0 μg/ml。采用MTT 法测定样品抗肿瘤活性[17]。以人肝癌细胞HEPG2，人胃癌细胞HGC27，人结肠癌细胞HT-29，人宫颈癌细胞HELA 为受试对象，阳性对照采用阿霉素。将细胞放置于含10%FBS、青霉素和链霉素各100 U/ml 的DMEM 细胞培养液中，于37 ℃、5% CO2饱和湿度的细胞培养箱中培养，48 h 换液传代。消化传代后显微镜下观察细胞的生长情况。取对数生长期的细胞，胰酶消化后，10%小牛血清的完全培养液洗涤、悬浮，将100 μl 悬浮细胞液（2～4×104个/ml）接种于96 孔板中，培养24 h。吸弃培养液，每孔加入100 μl 含有不同药物的完全培养基(含10%小牛血清，1%双抗)，每种浓度设3 个平行孔，设空白对照组，培养72 h 后，每个孔加入5 mg/ml 的 MTT 10 μl，培养4 h，吸弃培养液后加入100 μl DMSO，振荡至结晶完全溶解，用酶联免疫监测仪在波长为570 nm 处测定A值，计算各浓度下的细胞抑制率，计算方法如下：

阴性对照孔相对A值=阴性对照孔绝对A值—空白对照孔绝对A值

药敏孔相对A值=药敏孔绝对A值—空白对照孔绝对A值

本研究采用SPSS 17.0 通过机率单位加权回归法（Bliss 法）计算IC50。

3 结果与分析

3.1 内生真菌的分离鉴定及种群组成

将分离到的869 株内生真菌，根据培养特征划分为90 个形态型，对不同形态型菌株ITS 基因与GenBank 中的参考序列进行分子系统学分析，结果见表1，有结果可知，鉴定得到的内生真菌属于3 门、12 纲、14 目、14 科、18 属和30 种。

表1 根据BLAST 序列分离得到的泰山白首乌内生真菌

(续表1)

3.1.1 组织类型对内生真菌种群结构的影响

组织因素在影响内生真菌的多样性和分布规律发挥着重要的作用[18]，在属的水平上，其对泰山白首乌内生真菌的组成影响也较为显著，如图1 所示。泰山白首乌根部内生真菌主要分布于8 个属，其中，优势菌属为镰刀菌属Fusarium，占根中内生真菌的64.29%；泰山白首乌茎部内生真菌分布于9 个属，优势菌属为链格孢属Alternaria，占茎中内生真菌的60%；泰山白首乌叶部内生真菌分布13 个属，优势菌属为链格孢属Alternaria，占叶中内生真菌的56.25%；泰山白首乌内生真菌的叶丰度大于茎和根。3 个不同的组织部位中，链格孢属Alternaria和炭疽菌属Colletotrichum为三者共有属，其他具有差异。结果表明，在不同组织部位中，泰山白首乌的内生真菌的分布差异显著。

图1 泰山白首乌不同部位中内生真菌组成及占百分比（%，属）

3.1.2 产地对泰山白首乌内生真菌种群结构的影响

地理位置会影响内生真菌的多样性[19]。在90 个形态型内生真菌菌株中，产地济南的泰山白首乌分离39 个菌株，产地泰安分离得到26 个菌株，产地临沂分离得到25 个。如图2 结果所示，3 个产地的泰山白首乌优势菌属为链格孢属Alternaria和镰刀菌属Fusarium，产地济南的泰山白首乌内生真菌主要分布在12 个属，优势菌属链格孢属占38.46%，镰刀菌属占28.21%；产地泰安的泰山白首乌内生真菌主要分布在5 个属，优势菌属链格孢属占61.54%，镰刀菌属占26.92%；产地临沂的泰山白首乌内生真菌主要分布在11 个属，优势菌属链格孢属占48.00%，镰刀菌属占32.00%。由此可知，产地对泰山白首乌内生真菌的群落组成和优势菌群均有影响，群落组成影响较大。

图2 不同产地泰山白首乌内生真菌组成及所占百分比（%）

3.2 泰山白首乌内生真菌的抗肿瘤活性

MTT 结果表明，有13 株内生真菌菌株代谢产物对HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 肿瘤细胞株表现抗肿瘤活性，占总数的14.4%。如表2 所示，B.sorokinianaJTY6、A. alternateJTY10、A. brassicicolaJTJ11、B. ochroleucaJTJ18、Xylariaceaesp. LTJ1、A. tenuissimaLTJ2、C. acutatumLTJ3 和A. alternataLTJ6 抗肿瘤活性较明显。链格孢属Alternaria是泰山白首乌内生真菌中筛选出抗肿瘤活性菌株的优势菌属，其中，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 的抗肿瘤活性尤其显著，能够显著抑制HEPG2、HGC27、HT-29 和HeLa 肿瘤细胞株。A.tenuissimaLTJ2 对HEPG2、HGC27、HT-29、HeLa 4 种肿瘤细胞株的 IC50值分别为（2.21±0.61）、（3.11±0.46）、（8.25±1.11）、（3.85±0.60） μg /ml；A.alternataLTJ6 为（1.58±0.38）、（1.46±0.39）、（3.63±1.23）、（6.24±0.49） μg /ml。以上结果表明，A.tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 是泰山白首乌具有显著抗肿瘤活性的内生真菌株，可以进一步研究其产生抗肿瘤活性的单体成分。

表2 泰山白首乌内生菌菌株的抗肿瘤活性

4 讨论

泰山白首乌与“泰山黄精”、“泰山紫草”和“泰山四叶参”并称为泰山四大名药[2]，但因其自然繁殖率低等因素，导致资源匮乏，市场上供不应求。植物内生真菌与宿主长期协同进化，可以产生相同或相似的活性代谢产物[9]，通过对泰山白首乌内生真菌的深入研究将有效的缓解其资源匮乏，而内生真菌有可能成为开发泰山白首乌的新资源。

本研究表明泰山白首乌中内生真菌资源丰富，具有较丰富的多样性，泰山白首乌内生真菌的分布在不同组织部位差异显著，以丰度比较叶大于茎和根，具有明显的组织特异性，产地对泰山白首乌的优势菌群和群落组成有影响。除优势属、种外，分离得到的大豆疫霉、炭角菌和淡色赤壳菌等内生真菌菌株，也具有良好生物活性[20-22]。

植物内生真菌能产生与宿主相同或相似的活性成分及生物活性，本研究首次报道了筛选得到的13 株泰山白首乌内生真菌具有抗肿瘤活性，占总数的14.4%，其中，从叶中筛选到4 株抗肿瘤活性菌株，茎中筛选得到9 株抗肿瘤活性菌株，根中无，同时，A. tenuissimaLTJ2 和A. alternataLTJ6 两种抗肿瘤活性尤其显著，值得深入研究。然而，泰山白首乌的药用部位为块根，由于内生真菌在植物组织中的定殖不同，导致在不同组织部位的分布存在差异，具体原因还需要进一步深入研究。另外，从产地上来看，不同产地所筛选得到的抗肿瘤活性菌株数量及品种不同，济南产泰山白首乌筛选到5 株抗肿瘤活性菌株，临沂产泰山白首乌筛选到6 株活性菌株，泰安产泰山白首乌筛选到2 株活性菌株，综上，泰山白首乌中内生真菌的种群结构的抗肿瘤活性是否存在与产地相关，需要进一步深入研究，而已经分离得到的活性菌株的次生代谢产物及其作用机制的研究也是下一个重要目标。