胞外囊泡源性miRNA在胶质母细胞瘤中作用的研究进展

王明明 唐瑞天综述 刘建雄审校

作者单位：730000 兰州，甘肃中医药大学（王明明）；730000 兰州，甘肃省人民医院神经外科（唐瑞天）；750000 银川，宁夏医科大学（刘建雄）

胶质瘤是中枢神经系统最常见、最具侵袭性、预后较差的原发性恶性肿瘤，占颅内肿瘤的50%～60%。胶质母细胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM）属于脑胶质瘤的一种，WHO 分级Ⅳ级，恶性程度最高，即使积极手术联合放化疗，GBM 治疗效果仍然不佳，平均生存期大约17 个月[1]。本文就细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV）源性微小RNA（micro-RNA，miRNA）的生物学特性及其在GBM 中的作用研究进展进行综述。

1 EV的生物特性

EV是一类起源于细胞膜的微小颗粒，来源于激活CD4+和CD8+T 细胞抗原提呈细胞，依据起源、大小以及组成可分为凋亡体、外泌体、微泡、癌小体。凋亡体是最大的EV，大小1 000～5 000 nm，可促进细胞的程序性死亡。外泌体是一种最小的囊泡，通过质膜的外向出芽所形成，CD3 和CD9 被认为在外泌体形成中起关键作用[2]，直径30～100 nm，形态大致为杯状；也可起源于内体膜的内向出芽，多个的外泌体聚集形成多泡体。微泡起源于膜蛋白富积的质膜结构域，最具特征的外泌体能够在细胞间进行信息交流，不仅在正常生理过程中起重要的作用，也参与病理的发生发展，进行信息交流的物质有蛋白质、DNA、miRNA、mRNA、脂质和非编码RNA 等。癌小体，直径1～10 μm，起源于膜泡脱落，其中细胞角蛋白18 最为富集[3]，含有大量的参与局部侵袭的生物活性分子，与肿瘤进展相关。

脑组织分泌的EV参与神经元、胶质细胞以及内皮细胞之间的信息传递，调节血脑屏障的形成，以及神经系统的功能和神经再生等。GBM 中EV 含有miRNA 信号，有小部分反映肿瘤细胞起源的miRNA，也有少量miRNA 在肿瘤EV 中特异性富积。3'端腺苷化的miRNA 在细胞中相对富集，而3'端尿苷化的miRNA主要存在于EV中。

2 miRNA的生物特性

miRNA 属于一种家族性的微小非编码RNA，大小约22 个核苷酸，可调控多种细胞功能，如细胞增殖、分化、凋亡、细胞周期和组织发育[4]。miRNA 主要通过减少目的基因的表达，减少互补结合的mRNA 的3'端非编码区，导致mRNA 的快速衰变或阻止编码蛋白质的表达。miRNA 由RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，PolⅡ）通过蛋白编码基因或者内含区序列转录而来。虽然初级转录体通过DGosha-DGCR8 复 合 物，绕 过RNase Ⅲ，将 原 始miRNA切割为大小约70个核苷酸的茎环样前体；再由RNase Ⅲ酶DICER1进一步加工成具有22个核苷酸的双链miRNA，之后不稳定的miRNA双链加工修饰变成稳定的成熟单链miRNA。

成熟miRNA 生成并装载到argongaute 效应蛋白中，形成miRNA 诱导沉默复合物的核心，识别并结合mRNA 3'非编码区，通过seed 序列互补介导基因沉默[5]或抑制表达，促进miRNA 靶点降解。由于mRNA 靶向的复杂性，miRNA 可以靶向很多个不同的mRNA。因此，单独的一个miRNA 就能够有规律性的调控复杂的生物过程。

3 EV与受体细胞的相互作用

研究表明，受体细胞在体外和体内都对EV有很强的吸引力，EV似乎只是与它们特定识别的细胞相互作用。肿瘤来源的EV被器官特异性细胞内化，导致肿瘤细胞转移前的微生态改变[6]。EV与受体细胞相互作用的性质很关键，能通过直接刺激受体表面的受体而激发信号，并不需要进入受体细胞[7]。EV也可以直接与受体细胞的质膜融合，将其内容释放到细胞质中。这种细胞间转移通过致癌受体导致细胞内信号异常，进而导致受体细胞的转化。因此靶细胞可通过内吞作用把EV内化，但需要一个初始受体介导的结合步骤，然后达到内部化效应。在GBM的EV中，这种结合至少在一定程度上由硫酸肝素钠蛋白多糖介导。一旦内吞，EV可以通过与膜融合释放其在细胞质中的包含物，也可以通过相邻细胞间的连接，在细胞之间传递信号。

4 EV源性miRNA对微环境的调控

在GBM 中，EV 富集于几种致癌miRNA，包括miR-21、miR-23a、miR-30a、miR-221 和miR-451。在GBM 细胞间信息的传递过程中，EV 介导的致癌miRNA 可能是调控肿瘤细胞增殖、侵袭和生存的重要机制。同时，GBM 中EV 源性miRNA 可以转移到微环境中的非恶性细胞中，改变其表型，促进肿瘤进展。van der Vos 等[8]发现GBM 中EV 与小胶质细胞相互作用，传递miR-21、miR-451；小胶质细胞暴露于GBM的EV中，受体细胞中两种miRNA水平升高，导致共同靶细胞原癌基因水平降低。

在GBM进展过程中，缺氧环境可导致肿瘤细胞内应激反应通路的激活，导致mRNA和蛋白富积EV的产生。EV介导GBM和内皮细胞之间的缺氧依赖性细胞间通信，导致肿瘤新生血管的强烈激活。因此，EV组成的变化及其在缺氧环境下的影响可能是由于GBM细胞中miRNA信号的改变。有研究表明，在缺氧过程中，miR-210 可以通过EV 分泌，直接影响内皮细胞的反应。细胞miRNA 表达的变化可能在miRNA和蛋白组mRNA水平上影响EV的组成。

5 miRNA在GBM病理生理中的作用

GBM的miRNA表达失调，如miR-221表达显著上调，miR-128、miR-181a和miR-181b表达下调，其中miR-181a 的下调会降低胶质瘤对放疗的敏感性。同时，miRNA 影响多种细胞和分子途径，如调控胰岛素样生长因子结合蛋白-3、金属蛋白酶组织抑制因子等，进一步参与GBM的病理生理过程。

miRNA 可以通过促进肿瘤抑制基因的转移和沉默在癌症的发生和进展中发挥重要作用。有研究提示多种miRNA 在调控GBM 的发展和进程中具有致癌和抑癌的作用，如miR-543 通过金属蛋白酶-9调控GBM，起到抑癌作用[9]。GBM叉头蛋白M1的表达与miR-876-5p 呈负相关，叉头蛋白M1 的下调导致miR-876-5p过表达，其抑癌作用更明显[10]。GBM恶性增殖失控等显著特征的发生，不只是蛋白质编码基因信号通路的失活，也可能是基因间miRNA介导相互作用异常所导致。

6 miRNA对血管生成的调控

血管内皮生长因子及其受体是肿瘤诱导血管生成的重要介质，如血管抑制素、内皮抑制素、血栓反应蛋白-1、血栓反应蛋白-2等。血管的生成是内皮细胞向微血管中萌发，为肿瘤细胞提供营养与氧气的过程。血管生成与肿瘤细胞的浸润在肿瘤生长和转移方面成正相关，有基础作用，更具有促进作用。肿瘤的缺氧环境易诱导肿瘤血管的生成。在新的血管形成过程中，间充质干细胞可分化为周细胞，最后迁移形成新的血管。然而间充质干细胞在GBM 中的血管生成和miRNA修饰机制尚不清楚[12]。有研究表明miR-299参与GBM血管生成过程，牛磺酸上调因子1通过直接与miR-299结合调控肿瘤血管的生成[12]。miR-137 可通过直接靶向组蛋白-赖氨酸N-甲基转移酶的增强子，调控GBM的血管生成[13]。

7 miRNA对代谢的调控

代谢与肿瘤生长有关。miR-451 可作为GBM代谢和侵袭的强有力调控因子[14]。在高糖环境中，miR-451 在GBM 中保持高水平的表达，且通过直接靶向激活腺苷酸活化蛋白激酶的肝激酶B1，是腺苷酸活化蛋白激酶复合物的有效抑制剂。GBM 很显著的特征之一是有氧糖酵解，也被称为Warburg 效应。miRNA是一个控制细胞代谢相关基因的转录表达的关键性调控因子，可通过两种方式调节GBM糖酵解代谢。首先，miRNA 可直接调控GBM，参与糖摄取和糖代谢基因的表达，如miR-106a抑制葡萄糖转运蛋白3，促进糖酵解，提高葡萄糖通量。miRNAlet-7a 抑制M2 型丙酮酸激酶[15]，导致上游糖酵解中间体的积累。另外miRNA 可通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 和RAS 通路调控受体酪氨酸激酶的信号转导，间接调控糖酵解。

8 EV源性miRNA作为GBM生物标志物

单个多个microRNA 在肿瘤细胞和微环境中调控基因表达，可能是监测GBM复发和化疗反应的非常有价值的生物标志物。然而，最常用的检测手段活检术对GBM 肿瘤的异质性检测准确度不高。在人的血液[16]、唾液、脑脊液、滑液、房水[17]等体液中可检测到EV，可作为诊断和预后生物标志物。miR-21为GBM 中上调最多的miRNA 之一，通过诱导与caspase3活性，降低相关促凋亡蛋白表达，保护GBM细胞免受替莫唑胺诱导的凋亡。Qu 等[18]在meta 分析中指出，细胞外的miR-21可作为诊断脑肿瘤的生物标志物，其具有一定的准确性。

综上所述，EV 源性miRNA 在受体细胞中的摄取和处理的机制尚不清楚，但在GBM 的生长、侵袭过程中具有重要作用。