乳腺癌组织中长链非编码RNA-00707的表达及与分子病理分型的相关性

赵丽华，李 静，位 嘉，林秋兰

乳腺癌已成为全球最常见的恶性肿瘤，也是女性癌症的主要死因，发病率有逐年增高且呈年轻化趋势。随着分子生物学技术的发展，发现长链非编码RNA(long-chain non-coding RNA, LncRNAs)的表达异常可能与乳腺癌有关，因此对LncRNA的进一步分析可为乳腺癌诊疗提供新思路[1]。本实验以既往建立的间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)与乳腺癌细胞MCF7共培养模型为分析对象，在模拟肿瘤微环境的条件下分析肿瘤细胞转录组的动态变化，目的是寻找与促进乳腺癌进展、转移相关的关键LncRNA，探索其发挥作用的可能机制。在此基础上应用RNAscope技术检测乳腺癌及癌旁正常乳腺组织中长链非编码RNA-00707(long-chain non-coding RNA-00707, Linc00707)的表达水平，并结合乳腺癌分子病理分型，初步探讨Linc00707在乳腺癌诊断、预后的意义。

1 材料与方法

1.1 Linc00707的获取本课题团队前期试验建立的人源脂肪间充质干细胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells, hAD-MSCs)与人乳腺癌MCF7细胞系细胞间接共培养体系，并诱导MCF7细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transformation, EMT)，lncRNAs芯片技术获得一批差异表达的lncRNAs，并通过qRT-PCR验证，最终得到差异性表达的长链非编码RNA，命名为Linc00707[2]。

1.2 乳腺癌标本收集2015～2019年民航总医院病理科及衡道病理中心存档的石蜡包埋样本136例，癌旁正常乳腺组织78例。所有患者均为女性，年龄31～72岁，中位年龄41.2岁。依据2011年St.Gallen共识，乳腺癌分子病理分型分为4型：Luminal A型、Luminal B型、HER-2过表达型和基底样型[3]。

1.3 方法

1.3.1免疫组化 采用罗氏BenchMark GX全自动免疫组化染色系统，一抗ER(SP1)、PR(1E2)、HER-2(4B5)、Ki-67(30-9)均购自罗氏公司，CK14(MAB-0169)和EGFR(RMA-0688)购自福州迈新公司。

1.3.2组织芯片的制作 136例乳腺癌组织及78例癌旁正常乳腺组织由经验丰富的病理专家选择组织区，由有经验的技术人员参照文献[4]制作组织微阵列。

1.3.3RNAscope技术[5]采用RNAscope2.5HD检测试剂盒(美国ACD公司)检测Linc00707 mRNA的表达，主要步骤：标本制备，蛋白酶加处理，探针杂交，信号放大，DAB显色，苏木精复染。

1.3.4Linc00707显微镜下计数 参照HER-2 RNAscope染色分级计数方法[6]，于40倍物镜下计数100个癌细胞，RNA转录物在癌细胞核和细胞质内形成明显的点状或团簇状信号，平均每个细胞中<1个信号为0分；1～3个信号为1分；4～9个信号及无/少量呈簇状信号为2分；10～15个信号为3分(若<10%瘤细胞中的信号呈簇状也归为此类)；>15个信号为4分(若>10%瘤细胞中的信号呈簇状也归为此类)。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件对所有数据进行统计学分析，免疫组化和RNAscope结果采用χ2检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织中Linc00707的表达136例乳腺癌中121例Linc00707阳性，1分占9.1%(11/121)，2分占30.6%(37/121)，3分占40.4%(49/121)，4分占19.8%(24/121)(图1)。Linc00707在乳腺癌组织中的阳性率(89%，121/136))高于癌旁正常乳腺组织(3.8%，3/78)，差异有统计学意义(χ2=147.40，P<0.05)。

2.2 乳腺癌中Linc00707表达与分子病理分型的相关性根据免疫组化结果分型，其中Luminal A型19例，Luminal B型52例，基底样型26例，HER-2过表达型39例。χ2检验结果显示，Linc00707在乳腺癌病理分子亚型中的阳性率分别为Luminal A型52.6%(10/19)，Luminal B型98.1%(51/52)，基底样型88.5%(23/26)，HER-2过表达型94.9%(37/39)，Luminal B型、HER-2过表达型、基底样型中的阳性率高于Luminal A型(χ2=20.143、7.207、12.211，P<0.05，图2)。

3 讨论

浸润性乳腺癌是一组异质性极强的肿瘤，有各自不同的分子病理学特征和临床生物学行为，运用基因表达谱将乳腺癌划分为4种分子亚型，这些乳腺癌亚型具有不同的临床表现，对新辅助化疗的反应性和危险因素也各不相同，乳腺癌患者的临床治疗也变得更加具体和个性化，越来越多的机制研究使个体化治疗成为可能，使患者的预后更好[7]。

LncRNAs是指转录长度大于200个核苷酸并且不翻译成蛋白质的功能性RNA分子[8]。其最初被认为是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物，并无生物学功能。近年研究表明LncRNA参与基因组印记、X染色体沉默、染色质修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等多种重要的生理过程，LncRNA表达异常可能与肿瘤发生、发展、转移和预后密切相关，已成为当前肿瘤研究的新热点[9]。目前已鉴定出HOTAIR、NKILA、GAS5等近10种乳腺癌相关LncRNA，这些LncRNA可通过调控表观遗传修饰和关键细胞信号转导途径，影响乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭等重要生物学作用，参与乳腺癌恶性进展。因此深入探究LncRNA有望为乳腺癌诊断和治疗提供新的分子标志物[10]。

本实验应用hAD-MSCs与MCF7细胞共培养，发生EMT化的MCF7细胞与正常MCF7细胞进行LncRNAs芯片分析，并通过qRT-PCR验证，最终得到差异性表达的Linc00707，应用RNAscope技术检测Linc00707在乳腺癌组织中的表达及与分子病理分型的相关性，RNAscope是近年开发的一种新型RNA原位杂交技术，基于其独特的探针设计与背景抑制技术，使单个RNA的转录变得可视化，是目前最精准的RNA检测技术，该技术有三个特点：(1)可以对常规存档的石蜡组织、冷冻组织等进行检测，方便进行回顾性分析；(2)在保留组织形态学信息的基础上进行RNA的精确定量；(3)无需抗体，尤其适合低水平表达的RNA[11]。

为节省实验成本并提高效率，本实验把数十个至数百个患者的组织整齐有序的排列到同一蜡块上，制成组织芯片。其最大的作用是将基因、蛋白水平的研究与组织形态学相结合，应用同一实验条件同时观察大量不同患者组织样本(高通量)，减少实验误差，使实验结果更可靠，并节约实验成本和人力。本实验结果显示，Linc00707在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁正常乳腺组织，表明Linc00707在某种程度上可以促进乳腺癌细胞的增殖，与体外实验研究Linc00707可以促进MCF7细胞的侵袭和转移能力的结果符合，在Linc00707阳性的分级计数中2分(30.6%)、3分(40.4%)和4分(19.8%)表达高于1分(9.1%)病例，初步显示Linc00707可提示肿瘤细胞的生长活性，可以作为判断乳腺癌的增殖指标之一。

病理形态相同的乳腺癌，由于分子遗传学的改变，在分子水平上呈现高度异质性，导致患者预后及治疗的反应差异较大，激素受体阳性患者预后佳，如Luminal A型、Luminal B型，HER-2是一个预后差的指标，HER-2过表达型预后比Luminal A型及Luminal B型差，基底样型乳腺癌预后最差[12]。应用乳腺癌分子分型分析在某种程度上与患者预后及生存期有相关性，有研究显示，HER-2过表达型与基底样型的局部复发率分别为33.3%和14.8%，远处转移率分别为55.6%和40.7%，均高于其他两种亚型，HER-2过表达型与基底样型的中位无瘤生存期较短，HER-2过表达型和基底样型乳腺癌的病理学特征较差，且预后不良，而Luminal A型预后较好。本实验通过乳腺癌的分子分型分析显示，Linc00707在Luminal B型、HER-2过表达型、基底样型中的表达明显高于Luminal A型，结果表明Linc00707在恶性程度相对高的亚型中表达明显增高，初步提示Linc00707可以促进乳腺癌的发展，对乳腺癌的恶性程度评估有一定的临床意义及成为新的乳腺癌标志物具有潜在价值的可能性，对乳腺癌的治疗及预后起到一定的辅助作用，并有利于选择和研究更具针对性的个性化治疗方法。

(本实验获丁华野教授的鼎立支持，特此致谢！)