碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌实验室检测的研究

余 林，杨 璐，王玉明

（1.云南大学附属医院/云南省第二人民医院检验科，云南 昆明 650000；2.昆明医科大学第二附属医院检验科，云南 昆明 650000）

碳青霉烯类药物是目前临床治疗多重耐药肠杆菌科细菌引起的感染最有效的药物之一。因碳青霉烯类抗菌药物在临床广泛使用，碳青霉烯类耐药的肠杆菌科细菌（carbapenem resistance enterobacteriaceae，CRE）不断出现和增多，其在全球范围呈现出快速增长的趋势[1]，给公共健康带来了严重的威胁。CRE 是指对厄他培南、亚胺培南、美罗培南或多利培南任意一种碳青霉烯类耐药或产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。CRE 引起的感染具有较高的死亡率，特别是CRE 所导致的侵袭性感染（如血流感染）死亡率可达40%～50%[2]。随着CRE 感染发病率的不断增高，抗菌药物的选择和使用越发困难，特别是一些CRE 菌株出现多重耐药甚至出现泛耐药的特征，这使临床抗感染治疗面临更大的选择困境[3]。而实验室能够迅速精准地检测出CRE，对于防控耐药菌株的传播、指导临床医生用药等方面具有重要的价值。本文就耐药机制及表型、基因型以及酶免疫层析技术三大类CRE 检测方法作一综述。

1 CRE 耐药机制

1.1 产碳青霉烯酶 产碳青霉烯酶是CRE 最主要的耐药机制[4]。根据Ambler 分类，碳青霉烯酶主要分为A、B 和D 三类。A 类碳青霉烯酶包括KPC、GES、IMI、SME 以及SFC 等，最常见的是KPC，其中又以KPC-2 和KPC-3 常见。B 类碳青霉烯酶为金属酶，主要包括VIM、IMP、NDM、GIM、SPM，最常见的是NDM、VIM 和IMP。D 类碳青霉烯酶又称为苯唑西林酶（OXA），目前发现400 余种，肠杆菌科细菌最常见的是OXA-48 及亚型。从酶的类型来看，A 类和D类酶属于丝氨酸酶，B 类为金属β-内酰胺酶[5]。

1.2 外膜蛋白的缺失或合并产AmpC 酶或ESBLs 细菌 通过改变膜孔蛋白的结构可以降低与抗菌药物的结合率，产生这种外膜屏障可以介导肠杆菌科细菌对碳青霉烯类药物耐药[6]。并且大部分外膜蛋白缺失的菌株常常产AmpC 酶或ESBLs[7]，二者之间可以产生协同作用，从而增强细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性。

1.3 青霉素结合蛋白（PBPs）对碳青霉烯类药物亲和力下降 PBPs 不同位置的突变会导致某些菌株对不同类型的碳青霉烯类药物产生耐药。另外，编码PBP的基因突变也可导致对美罗培南和厄他培南的亲和力下降，这也会导致某些菌株对碳青霉烯类药物的耐药性增强[8]。

1.4 药物外排泵的高度表达 通过加入泵抑制剂能够证明外排泵活性存在，同时也证明存在着其他未知的外排泵导致药物敏感性的降低[9]。

2 CRE 检测方法

根据CRE 定义，临床上主要通过抗菌药物敏感性试验进行CRE 菌株的筛查。药物敏感性检测方法主要是KB 纸片扩散法测量抑菌环直径和最低抑菌浓度（MIC）测定[10]。此方法最为简单，临床微生物实验室最常使用，但该方法无法分辨耐药的类型，仍然需要通过表型检测来分析待测菌株对碳青霉烯类的耐药性以及是否产碳青霉烯酶，或者可以通过分子生物学技术确定菌株相应的耐药酶基因。

2.1 耐药表型检测方法

2.1.1 Carba NP 试验（CNP）CNP 试验是CLSI 在2015 年推荐检测肠杆菌科和铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶的方法。CNP 试验检测碳青霉烯酶的特异度和灵敏度都超过了90%[11]，且操作简单快速，适合临床实验室开展，但是仍然存在自制试剂效期短以及无法检测OXA 型碳青霉烯酶等问题。

2.1.2 改良碳青霉烯灭活试验（mCIM）和EDTA 改良碳青霉烯灭活试验（eCIM）mCIM 是CLSI 在2017年推荐检测肠杆菌科和铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶的方法，2018 年又加入了eCIM，两种方法联合使用可以用来区分丝氨酸碳青霉烯酶和金属β-内酰胺酶[12]。mCIM 检测碳青霉烯酶的特异度和灵敏度都超过了97%且容易操作[13]，联合eCIM 还能够区分丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶[14]，针对性指导临床使用抗生素，故适用于临床微生物实验室使用，但是也存在着耗时长的问题。

2.1.3 碳青霉烯酶抑制剂增强试验 根据3-氨基苯硼酸（APB）能够抑制A 类丝氨酸酶，EDTA 能够抑制B 类金属β-内酰胺酶的原理，可以用APB 和EDTA 来对CRE 进行检测和分类。此方法检测A 类丝氨酸酶和金属β-内酰胺酶的特异度和灵敏度都超过96%，特别对于单产酶的灵敏度可达100%[15]。碳青霉烯酶抑制剂增强试验具有操作简单，可检测单产A 类丝氨酸酶或金属β-内酰胺酶以及同时产酶的特点，故适合临床微生物室常规使用。

但上述方法不能检测产D 类OXA-48 型酶，针对这一情况，Tsakris A 等[15]报道了一种改进的试验方法，其将亚胺培南贴于刷有0.5 麦氏浊度的大肠埃希菌ATCC25922MH 平板中央，左右两边贴含有待测细菌的纸片，左侧滴加EDTA，右侧滴加EDTA和APB，孵育18～20 h 后观察结果。这种改进后的方法特异度和灵敏度都超过96%[16]，可作为补充方法测定产D 类OXA-48 型酶，适合临床实验室常规使用，仍存在需购买特殊试剂和孵育时间长的缺点。

2.1.4 基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）MALDI-TOF MS 技术通过离子质量电荷之比与离子飞行时间成正比的检测原理，测定待测菌的分子量来进行鉴定。近几年，随着飞行质谱在临床微生物实验室的投入与使用，MALDI-TOF MS 在细菌耐药性检测方面的能力越来越得到重视。此方法的特异度为97.9%，灵敏度为96.7%[17]，检测快速，但目前没有统一操作方法且质谱仪价格昂贵，无法标准化，故不适合临床实验室常规使用。

2.2 基因型检测方法

2.2.1 PCR 法 PCR 法是检测碳青霉烯酶的金标准，但传统PCR 方法操作繁琐以及通量低，近年来基于PCR 检测原理提出了实时荧光PCR（qPCR）和多重PCR（mPCR）的方法。qPCR 是通过比较标准品与待测样品的荧光信号来准确定量的方法[19]，常见的有GeneXpertCarba-R、Filmarray 血流感染或肺炎检测试剂盒、Verigene 革兰阴性菌血培养鉴定试剂盒等方法对最常见的碳青霉烯酶包括KPC、IMP、NDM、VIM、OXA-48 进行基因检测，特异度和灵敏度可达96%以上[18]。mPCR 是通过将多对特异引物加入到一个反应体系中来进行多种目的基因检测的方法[19]。mPCR 可准确快速地对临床标本中主要的碳青霉烯酶基因OXA-48、VIM、IMP、NDM、KPC 进行检测。PCR 法都具有高特异度和灵敏度的特点，缺点是需要特殊仪器设备，不适合临床微生物实验室使用。

2.2.2 环介导等温扩增法（LAMP）LAMP 是利用聚合酶扩增基因BST，以SYBR 为指示剂检测KPC、NDM、IMP、VIM 基因，经研究发现[20]，其结果与传统PCR 方法完全一致。此方法结果判读肉眼可见，反应时间短，具有高灵敏性，但目前并未规范化统一应用于临床。

2.2.3 基因芯片 基因芯片是利用杂交测序的原理将已知序列的基因探针按顺序固定，通过与待测样本杂交后采集标记信号来进行分析的方法[19]。基因芯片不仅可以进行各种微生物的鉴定，也可以用于细菌耐药基因的检测，它能直接测定产酶菌株，显著缩短检测周期[21]。但就目前而言，基因芯片各方面要求更高，也不能常规应用于临床微生物实验室。

2.2.4 二代测序（NGS）NGS 是一种全基因组的测序方法，具有高解析度、输出量的特征。NGS 功能强大，不仅可以测定所有碳青霉烯酶基因，还可以发现其他非产酶的耐药机制[22]。该方法具有全面、快速、高效的特点，但因价格昂贵、技术要求更高等原因，开展更是受到更多限制，可能对于高端科研机构更适宜开展。

2.3 酶免疫层析技术 酶免疫层析技术是一种利用抗体介导检测产酶的免疫学方法。它通过CHLBs 免疫小鼠来获得单克隆抗体，利用抗原抗体特异性反应原理来检测待测细菌的碳青霉烯酶，特异度和灵敏度可达到100%[23]。此方法具有操作省时且快速准确，但只能对目标酶型进行检测，试剂成本高，仍然存在一定的局限性。

3 总结

从报告的结果而言，CNP 和MALDI-TOF MS 仅能够报告是否产碳青霉烯酶，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制剂增强试验可以区分A 类丝氨酸碳青霉烯酶与B 类金属β-内酰胺酶；对于基因型检测方法都可直接报告检测到的碳青霉烯酶基因；对于酶免疫层析技术仅可以报告几种常见的碳青霉烯酶基因。从检测时间而言，MALDI-TOF MS 最快仅需20 min，CNP 需要4～6 h，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制剂增强试验都需要过夜孵育观察结果；基因型检测方法所需时间也大多在1 h 左右；酶免疫层析技术所需时间最短仅15 min。总之，CNP 因需自制试剂以及无法检测OXA 型碳青霉烯酶不推荐使用，MALDI-TOF MS 虽检测快速但因需自配抗菌药物溶液且无标准化操作也不推荐，mCIM、eCIM 和碳青霉烯酶抑制剂增强试验针对临床微生物实验室高度推荐常规使用；基因型检测方法快速准确且可测基因型，推荐应用于科研；酶免疫层析技术操作最为简便且检测速度最快，希望在不久的将来可以降低试剂成本，扩大靶基因的检测，从而广泛应用于实验室。