浅谈基层开展荧光PCR试验的注意事项

高爱萍

（江苏省徐州市畜牧兽医站 221000）

近几年，随着生物技术的迅猛发展，分子生物学技术在各行各业得到广泛应用，PCR是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)的简称，是上世纪80年代中期发展起来的一种体外扩增技术，用于放大特定的DNA片段，该技术在体外可在短时间内获得大量特定目的基因片段，通过DNA基因追踪系统能迅速掌握体内的病毒含量，其精确度高达纳米级，从而大大简化了传统的分子克隆技术。而实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中通过荧光信号对PCR进程进行实时检测的技术，在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，成为定量依据。实时荧光定量PCR具有敏感，快速，高通量，简便、自动化程度高等突出优势，目前已成为疫病流行病学调查中病原检测及病原学诊断的常规操作技术之一。

随着我国畜牧养殖业的发展，及畜禽进出口贸易的加大，动物疫病也不断发展，尤其是近几年非洲猪瘟、小反刍兽疫、牛结节病等外来疾病的侵入，给传统的实验室诊断和流行病学调查带来严峻挑战，为应对这一形式，实时荧光定量PCR技术在实验室诊断和流行病学调查中得以广泛应用。但该实验条件、技术要求高，目前虽然一部分基层实验室具备了实时荧光定量PCR检测技术的资质，也得到农业农村部及省级主管部门通过不同方式的考核及授权，能开展实时荧光定量PCR技术检测工作，但在实际检测工作的各个环节仍存在很多影响因素，造成检测结果不准确，出现假阳性、假阴性的结果，笔者近几年一直从事兽医实验室PCR检测工作，现参考相关资料，从实时荧光定量PCR检测过程的不同环节、不同层面分析存在的影响因素，提出消除因素的方法。

1 人员方面

（1)从事PCR试验的检测人员必须参加农业农村部或省级动物疫病控制中心举办的PCR检测技术培训班，切实掌握PCR检测技术的检测原理、方法和步骤，经考核合格后方可上岗操作，试验操作时严格按照PCR试验操作规程、检验流程进行各项实验活动。

（2)积极参加行业部门组织的培训及交流，不断扩充新知识，提高业务技术水平。

（3)积极参加上级业务部门组织的盲样比对试验，不断提高检测技术能力和检测技术水平。

2 实验室管理方面

（1)做好实验室建设管理，制定科学合理的实验室各项规章制度。主要包括实验室生物安全制度，实验室岗位责任制度，样品的采集、运输、保存制度，仪器设备的使用、维护管理制度，实验室安全操作管理制度，实验室废弃物处理制度，实验室清洁消毒制度，实验室试剂保存使用制度，实验室记录、检验报告的审核制度等。

（2)制定实验室标准检验操作流程，制定仪器、设备的使用标准操作程序。主要包括生物安全柜的使用标准操作程序，核酸提取仪的使用标准操作程序，PCR仪的使用标准操作程序，离心机的使用及维护程序，样品的准备及核酸提取操作程序，试剂配制操作程序等，以确保实验室的日常运作符合试验要求，确保检测结果的准确性，确保实验室的各项生物安全等。

（3)完善实验室各项记录，主要包括药品、试剂采购、使用记录，样品收集、使用记录，实验室的各项检验原始记录，仪器设备的使用及维护记录，消毒记录，废弃物处理记录，冰箱温度记录及检验结果报告记录等。

3 功能区布局方面

（1)依据荧光PCR试验检测流程可将荧光PCR实验室分为配液区（核酸扩增试剂的配制、分装和保存)、样品准备区（样品的登记、分装；核酸的提取、保存和加样)、核酸扩增区(核酸扩增、结果分析、登记及报告)3个完全独立的区域，以防止交叉污染。整个PCR实验室需有一个整体的缓冲区，同时每个独立的分区也应有单独的缓冲区。

（2)各区域的空调通风系统要设置合理，各缓冲区的排风扇往外排气，在实验区的外墙上和各扇门上安装可调的回风口，空气通过回风口向室内换气。

（3)试验区空气流动按配液区→样品准备区→核酸扩增区单一走向，做负压设计，使气流定向流动，避免扩增产物回流造成污染，各区通过机械连锁不锈钢传递窗传递试剂和样本。

4 仪器与设备方面

（1)根据需要，每个不同的区域应配备相适应的设备、仪器、耗材，且各个区域的设备、仪器、耗材应无污染，并做明显的标记，各区不能混用。

配液区：超净工作台、合适量程的加样枪，枪头，冰箱，台式低速离心机，混匀器，可移动紫外灯，专用垃圾桶等。

样品准备区：生物安全柜，冰箱，全自动核酸提取仪，合适量程的加样枪，枪头，台式低速离心机，台式高速离心机（冷冻及常温)，混匀器，可移动紫外灯，专用垃圾桶等。

扩增区：实时荧光PCR扩增仪，通用电脑，自动分析软件，专用垃圾桶等，检测设备必须符合标准PCR荧光实验室设置要求。

（2)所有仪器和设备均需严格按照标准操作规程和注意事项进行使用，并定期进行维护和校正。

5 规范操作方面

实验人员进入工作区域应按照单一的方向进行各项操作工作，由配液区→样品准备区→核酸扩增区，禁止由核酸扩增区逆行至其他两个区域。进入不同区域需穿戴各区域专用的工作服、手套、口罩、帽子，切忌从核酸扩增区穿着工作服，戴手套和帽子逆行到核酸提取区；发现手套有污染时应立即更换；试验完成离开工作场所时要脱掉手套，更换工作服。

5.1 试剂配制

配制扩增试剂体系需在配液区的超净工作台内进行，所用耗材确保无污染，最好使用带滤芯的加长枪头。选择质量好的EP管，加入反应体系，各试剂在取用前应先瞬时离心，确保管盖上的试剂沉于管底；打开管盖动作要轻，吸取试剂要慢，吸样尽量一次完成，忌多次抽吸，以防止管内液体溅出或产生气溶胶而污染环境。

5.2 样品制备（核酸提取）

接收样品时要确保样品密封完好、编号清楚且具有唯一性，严格按操作规程进行加样，操作时尽量少说话，所有操作需要在生物安全柜内进行，操作前后生物安全柜需要进行紫外灯消毒，安全柜内的物品要摆放整齐、便于操作。核酸提取后小心加入已加入反应液的EP管中，同时设立阴阳对照，小心盖紧盖子，上机前混匀、离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底。

5.3 核酸扩增区

上机前需检测荧光PCR仪的各项指标，确保仪器能正常运行。

6 控制污染方面

由于极微量的核酸污染即可严重影响检测结果的准确性，导致出现假阳性、假阴性的结果，因此，整个PCR试验过程始终保持“无核酸观念”，时刻注意避免来自样品、试剂及试验各个环节的操作污染，尤其防止形成的气溶胶对环境造成污染。

（1)实验前对整个试验区域进行彻底消毒，包括环境、仪器设备耗材，工作服等。

（2)与试验无关的人员禁止入试验区域内，并减少不必要走动，减少交叉污染。

（3)试验前后需用紫外线照射整个试验区域，时间不低于30min，并用含有效氯1000mg/L消毒剂擦拭仪器表面、工作台和地面。

（4)整个PCR试验结束后，所有实验废弃物尤其是核酸扩增区的废弃物必须先浸泡于含有效氯1000mg/L消毒剂中60min以上，经高压灭菌后按医疗垃圾废弃物统一处理，同时清理实验操作台面，并用消毒剂擦洗干净。

（5)实验室要经常通风换气和消毒，以消除试验过程中产生的气溶胶。

总之，实时荧光PCR技术是一项灵敏度高且又快速的检测技术，目前已成为兽医实验室流行病学调查及疾病诊断的主要检测技术，在实际操作中一定要严格按照标准操作程序进行操作，尽量消除影响检测结果的因素，确保检测结果的准确性，为动物疫病防控提供科学依据。