应激耐受多系分化细胞治疗糖尿病足溃疡机制的研究进展

罗浩铭，白钦钦，王金晶，贾军，马印东，黄国宝

(1.潍坊医学院研究生院，山东 潍坊 261053； 2.贵州医科大学研究生院，贵阳 550025；3.山东大学附属济南市中心医院烧伤整复外科，济南 250013)

目前我国糖尿病患者数量庞大，根据流行病学统计，我国18岁及以上人群糖尿病患病率为11.2%[1]，患病人数约1.14亿，居世界首位[2]，且呈逐年上升趋势。糖尿病足溃疡是糖尿病的严重并发症之一，患病率占糖尿病患者的15%～25%[3]。在非创伤性下肢截肢的患者中约85%患有糖尿病足溃疡[4]，膝盖以上截肢患者的术后死亡率与结肠癌术后5年死亡率相同，仅次于肺癌[5]。目前糖尿病足溃疡的整体治疗效果不容乐观。传统的治疗方法包括控制血糖、预防感染以及足部溃疡手术清创。近年来，大量新型技术被应用于临床，如生长因子及双层人工真皮的应用、负压吸引术、高压氧疗法、超声辅助清创术等均取得了较好的疗效[6-10]。因糖尿病足溃疡发病机制复杂多样，上述方法也存在一定的局限性。近年来，应激耐受多系分化细胞(multilineage differentiating stress enduring cell，Muse细胞)的发现为糖尿病足溃疡等慢性创面的诊疗提供了新思路。Muse细胞是存在于间充质干细胞中的一类特殊细胞，具有三系分化潜能和多能标志物，在组织修复中具有独特的优势。Muse细胞在各种动物实验中均取得了良好的治疗效果[11-13]，且避免了传统手术的高风险，成为治疗糖尿病足溃疡等慢性难愈性创面的研究热点。现就Muse细胞治疗糖尿病足溃疡机制的研究进展予以综述。

1 Muse细胞

1.1Muse细胞的来源与特性 干细胞在现代医学中具有重要地位，可能用于治疗各种疑难病症。但干细胞可能具有致瘤和致畸性，且在缺氧、营养物质缺乏、促炎因子和活性氧类的局部微环境中存活率极低，所以临床应用受限。2010年Kuroda等[14]首次报道了Muse细胞，他们发现人类间充质干细胞中含有一小部分独特的多能干细胞子集，在体内或体外可分化为内胚层、中胚层和外胚层3个胚层。该多能干细胞子集在经过胰蛋白酶处理8 h或16 h后，直径>25 μm的大部分细胞表达多能性标记(Nanog基因、Oct3/4基因、特异性胚胎抗原-3和蛋白酶活化受体-4等)。Muse细胞不仅可以自我更新分化，而且高分化率比例可达80%～95%。Ogura等[15]通过动物实验发现，Muse细胞具有低端粒酶活性，且在体内不具有致瘤性，这使其能相对安全的用于临床。研究表明，多能干细胞仅由Muse细胞产生，它扮演着间充质干细胞和多能干细胞的角色，并且成为多能干细胞的理想来源[16-18]。值得注意的是，Muse细胞通过局部或静脉注入损伤部位后，在压力、缺氧和营养物质缺乏的微环境中自发分化为特异性细胞，在体内补充缺损丢失的细胞，有助于组织再生和修复。Muse细胞的分离可能对再生医学和细胞治疗产生重要影响。

1.2Muse细胞的分离 Muse细胞位于除基底膜外几乎所有器官的结缔组织中，可从间充质干细胞、脂肪组织、皮肤纤维细胞和骨髓基质细胞中分离，占间充质干细胞的1%～6%[14-15]。非Muse细胞不能表达特异性胚胎抗原-3，因此特异性胚胎抗原-3可用于Muse细胞的分离。目前Muse细胞的分离多使用胰蛋白酶分离、磁珠分离或流式分选。此外，Heneidi等[19]利用脂肪抽吸的方法，在细胞严重应激(长时间蛋白水解酶消化、低温、血浆缺乏和缺氧)环境中分离得到脂肪组织来源的Muse细胞，且特异性胚胎抗原-3阳性表达率高达60%[20]。脂肪来源Muse细胞在特异性诱导分化培养基中均能向3种生殖系细胞分化，其中间质分化率为82%，内胚层分化率为75%，外胚层分化率为78%[19]。与其他几种方法相比，脂肪抽吸法更快捷、有效，并且在丙烯酸酯/丙烯酰胺聚合物中成簇生长，同时该聚合物能促进未分化状态的Muse细胞的黏附、增殖和维持，提高Muse细胞的分离效率[21]。

2 Muse细胞治疗糖尿病足溃疡的机制

目前已有Muse细胞药物制剂进行临床药物试验，用于观察治疗糖尿病足溃疡的临床疗效。Muse细胞药物制剂是通过从活生物体的间充质组织或培养的间充质干细胞中分离特异性胚胎抗原-3阳性多能干细胞制成的细胞制剂。基于皮肤组织的再生机制，将Muse细胞药物制剂用于糖尿病足溃疡受试者足部创面时，Muse细胞可分化为表皮细胞、角质形成细胞和成纤维细胞等构成皮肤组织的细胞。Muse细胞恢复组织功能的能力表明其在细胞应激和急性损伤有关的细胞机制中有一定的积极作用[22]。

2.1增加低氧微环境中生长因子的分泌 糖尿病足溃疡的愈合是一个复杂的生物学过程，包括一系列交叉级联反应，如炎症反应、细胞增殖迁移和伤口重塑，且需要各种修复细胞、生长因子和细胞外基质的相互协调[23]。生长因子是组织修复再生的关键分子，目前已经发现了10余种生长因子，涉及并调节伤口愈合的各个阶段[24]。生长因子具有广泛的生物学活性，能刺激中胚层和外胚层中的细胞生长和增殖，从而促进毛细血管和神经组织再生，同时其还能刺激上皮细胞和内皮细胞增殖，以及促进溃疡肉芽组织增生[25]。糖尿病足溃疡由于血管病变，长期处于低灌注状态而导致组织严重缺氧。生长因子在组织修复中起重要作用，但在缺血缺氧的溃疡创面中含量较低。从糖尿病足溃疡组织中分离出的角质形成细胞和成纤维细胞增殖潜能较低，且生长因子水平低于正常组织[26]。Bauer等[11]研究发现在干细胞治疗肢端缺血过程中，仅有极少部分干细胞能够迁移至缺血性创面，这部分干细胞极有可能是Muse细胞。有动物实验将链脲佐菌素注射于小鼠腹腔内破坏胰岛β细胞，制作糖尿病小鼠模型。小鼠血糖达标后，在背部用打孔器打孔并将Muse细胞注射在伤口周围的四个点，此后连续记录伤口的愈合情况。结果显示，在相同氧含量下Muse细胞组的伤口愈合时间短于对照组，在低氧环境(1% O2)中表皮生长因子、血小板源性生长因子、神经生长因子、干细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β表达上调，表明血小板源性生长因子、转化生长因子-β和碱性成纤维细胞生长因子参与伤口愈合的初始凝结阶段[27]。同时，转化生长因子和碱性成纤维细胞生长因子对干细胞的增殖有促进作用，这形成了一个良性循环，可更好地促进伤口愈合。Muse细胞促进伤口愈合的机制尚待进一步阐明，在低氧条件下分泌大量生长因子可能是其加速皮肤修复过程的重要原因之一。

2.2促进上皮和肉芽组织生成 在糖尿病足溃疡的修复过程中，成纤维细胞迁移至创面，与创面新生的毛细血管形成肉芽组织来修补缺失的组织。同时，角质形成细胞和成纤维细胞从创面边缘通过迁移、增殖和分化三个阶段逐步封闭创面。Muse细胞可在肉芽组织生成和再上皮化中发挥独特优势。Rogers等[13]将骨髓源性干细胞应用于3例糖尿病足溃疡患者的足部创面，13 d后所有患者创面均长出了肉芽组织，再配合使用皮肤移植物，伤口愈合时间明显缩短。Muse细胞在整合到糖尿病小鼠的缺损皮肤后，可分化为真皮成纤维细胞和毛细血管，在骨形态发生蛋白4因子的作用下还能分化为角质形成细胞，从而修复皮肤组织[28-29]。Takeshi等[30]用转化生长因子-β2和抗坏血酸将Muse细胞培养2周后，观察到成纤维细胞标志物，如Ⅰ型和Ⅳ型胶原复合物。Ⅳ型胶原复合物的端粒酶活性低于人原代成纤维细胞，表明Muse细胞可生成功能性成纤维细胞，而无需任何外部基因转导。Muse细胞还可产生细胞外基质蛋白，保护细胞免受有害环境的侵害，以帮助伤口愈合，并增强新组织的再生。在促进上皮再生的同时，Muse细胞可根据其抗炎和免疫调节功能对上皮细胞发挥保护作用[31]。深度创面的愈合周期较长，面积大于3 cm×3 cm且伤及皮肤全层的深度创面通常无法自愈，需手术覆盖创面。Muse细胞的应用则可加快角质形成细胞和成纤维细胞的迁移速度，最大限度地减轻患者的痛苦。

2.3抗炎和免疫调节作用 糖尿病足溃疡创面覆盖大量坏死组织，同时还伴随着巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞及各种炎症因子的浸润。足部破溃创面长期不愈合，炎症由急性转为慢性，细菌也可从局部定植进展为全身感染。慢性炎症的发生大大延长了糖尿病足溃疡的愈合时间，增加了治疗难度和患者风险。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，研究发现，当受损的胰岛β细胞产生的自身抗原被抗原呈递细胞识别并激活促炎反应时，Muse细胞可调节免疫系统从而维持胰岛β细胞的功能，使胰岛β细胞能够相对稳定地分泌胰岛素来控制血糖[32]。Muse细胞可通过激活蛋白激酶A信号转导通路、法尼醇X受体/视黄醇X受体和肝X受体/视黄醇X受体途径的蛋白质受体来调节局部炎症反应和免疫反应[33]。此外，Muse细胞还能产生多种免疫调节的介质，包括血红素加氧酶-1、吲哚胺-2，3-双加氧酶、基质金属蛋白酶和一氧化氮。T细胞和巨噬细胞分泌的γ干扰素和肿瘤坏死因子-α可加重局部炎症反应，而Muse细胞可通过减少T细胞和巨噬细胞的分泌而减少促炎因子的产生。Perone等[32]在脂多糖刺激实验中发现，脂多糖可显著诱导RAW264.7细胞分泌肿瘤坏死因子-α，然而在Muse细胞培养基中肿瘤坏死因子-α分泌减少。Sun等[31]研究证实，Muse细胞具有分泌抗炎细胞因子(如转化生长因子-β、白细胞介素-10和补体C3)并拮抗其免疫调节的功能，还能减少促炎因子(白细胞介素-6、γ干扰素)的分泌[34-35]。另有研究发现，Muse细胞能直接减轻炎症反应[23]。由此可见，Muse细胞可最大限度地调节局部炎症因子的分泌、抑制炎症反应及调节免疫功能，进而加速溃疡愈合。

2.4定向分化潜能 再生医学的目标是通过补充丢失的细胞来恢复缺损组织结构和功能。糖尿病足溃疡患者常并发周围神经血管病变，可发生皮肤浅表溃疡、脂肪肌肉坏死、深部溃疡甚至发生骨髓炎及全足坏疽而导致截肢。临床上通常需要对糖尿病足患者进行无创动脉评估(如经皮氧分压测定、踝/肱指数、阶段性多普勒测压)和下肢感觉的评估来判断严重程度，足部溃疡组织缺损的程度也被作为糖尿病足溃疡分级的标准之一[36]。Muse细胞能较敏感地接收受损组织的信号，并在损伤部位定向分化为相应缺损的细胞促进组织修复。在不同动物疾病模型(如急性重型肝炎、肌肉变性、皮肤溃疡、肝硬化、脑卒中、白癜风和局灶性节段性肾小球硬化)中，Muse细胞能有效地进入受损组织并分化为特定的细胞，促进组织再生和功能恢复[37]。如在急性重型肝炎动物模型中，将带有荧光标记的Muse细胞注射到急性重型肝炎小鼠的肝和肌肉中，这些Muse细胞可整合和自发分化为肝细胞和骨骼肌细胞来修复缺失组织；同时，可观察到Muse细胞迅速分化为真皮成纤维细胞、血管内皮细胞和角质形成细胞等，在微湿微酸等适宜的微环境下其修复皮肤组织缺损的效果更佳[17]。Muse细胞作为多能干细胞的理想来源，可在糖尿病足溃疡处分化为多种缺失细胞以修复缺损组织。

2.5其他机制 Muse细胞还有多种机制协同促进糖尿病足溃疡的愈合。在分子层面上，如通过碱基对切除修复和核苷酸切除修复来修复DNA[38]，在过氧化氢和紫外线照射的环境下，Muse细胞的衰老和凋亡水平均低于非Muse细胞，这与损伤后DNA损伤修复系统被激活有关[29]。在细胞层面上，Muse细胞可修复成纤维细胞的表观遗传特征和细胞功能，使成纤维细胞加速迁移、增生，从而加速溃疡愈合[39]。在一项糖尿病小鼠实验中，Muse细胞组小鼠腹腔内注射Muse细胞，对照组小鼠腹腔内注射等量0.9%氯化钠溶液，1周后生理盐水组平均血糖>27.8 mmol/L，而Muse细胞组在观察的7周内血糖水平为11.2～27.8 mmol/L，且Muse细胞组7周内体重保持稳定[31]。由此可见，全身用药不仅可修复局部溃疡创面，稳定胰岛素功能，还能保持体重，降低并发症的发生风险。

3 小 结

Muse细胞可通过多种机制实现组织再生，具有较好的应用前景。Muse细胞除用于糖尿病足溃疡等慢性创面的愈合外，还可用于脊髓损伤、烧伤、慢性肾脏病等疾病的治疗。尽管大量证据表明Muse细胞是一种独特的具有再生潜能的多能非致瘤性干细胞，但临床研究较少，仍以动物实验为主。目前用于研究的Muse细胞多源于几种间充质干细胞，这些间充质干细胞可以在不同的小鼠动物模型中促进受损组织再生。Muse细胞在组织修复中具有独特优势，但应用于临床仍面临巨大挑战。如何获得大量纯化的Muse细胞以及提高细胞存活率有待进一步研究，此外，其安全性尚需临床观察证实。