MMP-2在糖尿病视网膜病变中的作用

王宁，李志坚，刘平，苏胜

(哈尔滨医科大学附属第一医院眼科医院三病房，哈尔滨 150001)

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病重要的眼部并发症。首次诊断出糖尿病时，约15%的患者患有一定程度的DR，且大多数患者将在20年后出现这种微血管并发症。这一并发症是劳动年龄(20～65岁)人群视力下降的主要原因。虽然DR不是一种致命性疾病，但会造成患者心理上的困扰、降低日常生活能力，从而显著影响其生活质量[1]。DR的早期诊断可以预防或延缓视力丧失并减少相关治疗成本，然而DR早期无症状，通常发展到晚期才被发现，因此治疗的有效性大大降低。目前，DR的治疗策略旨在控制微血管并发症，包括玻璃体内注射药物、激光光凝和玻璃体手术。但现有的治疗方法存在一定的局限性，如治疗周期长、费用昂贵以及治疗效果欠佳。因此，寻找新的、有效的治疗药物迫在眉睫。

微血管细胞损害是DR的早期病理改变，而视网膜缺血缺氧引起新生血管出现则是DR增殖期的重要标志。在DR的发病机制中，视网膜毛细血管细胞(周细胞和内皮细胞)的氧化应激——线粒体功能障碍和凋亡早于微血管组织病理学特征出现[2]，提示早期细胞凋亡加速可以引发微血管结构受损。而基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2参与细胞凋亡及新生血管产生的过程[3]，因此MMP-2可能被高糖环境激活进而参与DR的发生和发展。现就MMP-2在DR中的作用予以综述，以开发出新的治疗药物早期干预DR的发生或减缓疾病的发展。

1 MMP-2的生物学特性

MMP是锌和钙依赖性内肽酶，根据MMP是分泌到细胞外基质还是锚定在细胞表面分为分泌型和膜结合型两种。而根据优先选择的底物MMP可以分为5类：胶原酶(MMP-1、8、13、18)，明胶酶(MMP-2、9)，溶血素(MMP-3、10、11)，膜型MMP(MMP-14、15、16、17、24、25)和其他(MMP-7、12、19、20、21、22、23)[3]。MMP的一级结构各不相同，但它们均与活性部位的锌离子、信号肽和丙肽共享一个保守的催化结构域。除基质溶血素和MMP-23外，大多数MMP均有一个血红素样结构域，该结构域在底物识别、诱导自身活化以及与抑制剂和细胞表面受体结合方面发挥重要作用[4]。MMP的活性受内源性组织金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)调节。

MMP-2是分泌到细胞外基质的明胶酶，其分解Ⅳ型胶原，保持基质的合成和降解平衡。而在未激活时，MMP-2表达为无活性的酶原形式(ProMMP-2)。ProMMP-2丙肽中的自由锌连接硫醇基，以保持酶原的稳定，直到通过“半胱氨酸开关”激活[5]。MMP-2与骨关节[6]、心脏、眼等部位疾病和肿瘤的发生有关。基于MMP-2的蛋白水解活性，其在细胞增殖、侵袭和凋亡以及细胞外基质产生与降解的平衡等过程中发挥重要作用。此外，活化的MMP-2还可以通过促进新生血管的形成和调节细胞间黏附等过程促进肿瘤的侵袭和转移[7]。Wang等[8]发现，主动脉瓣二瓣化患者的血浆MMP-2表达水平异常升高，其破坏包括弹性纤维和胶原纤维在内的细胞外基质各种成分，且升主动脉内皮细胞凋亡亦增多，导致升主动脉体积增大和弹性功能受损，最终导致动脉重构。同时，MMP-2还能使老年主动脉瓣细胞凋亡明显增多，分解明胶活性增强，降解细胞外基质和基膜成分，降解产物的聚集使得瓣膜增厚，钙盐易于沉积。另有研究显示，MMP-2的激活参与了DR的发病[9]。

2 MMP-2参与DR发生发展的调控机制

DR的进展与视网膜微脉管系统异常有关，包括血视网膜屏障通透性增加，血管内皮细胞和周细胞丢失，血管基膜增厚，毛细血管闭塞，视网膜神经元和神经胶质异常增生以及新生血管生成[1]。MMP-2在DR的发展中起双重作用。在早期阶段(新生血管发生之前)，MMP可能具有细胞内作用，它们促进视网膜毛细血管细胞凋亡，导致周细胞和内皮细胞丧失，这是早期DR的特征[10-11]。然而在疾病后期，MMP可能起到细胞外蛋白酶的作用，从而促进新生血管在增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)中的发展[12]。

2.1早期介导线粒体损伤-细胞凋亡 在DR发病过程中，氧化应激引起的线粒体活性氧类(reactive oxygen species，ROS)是调节细胞凋亡的活性介质[12-13]。在生理条件下，以活性氮、ROS、羟基自由基和过氧化氢为主的自由基产生是正常的。事实上，中低水平的自由基是生理活动所必需，因为它们作为氧化还原信号的信使，促进细胞代谢、增殖、分化、免疫系统调节和血管重构。正常生理状态下，细胞使用酶和非酶抗氧化防御系统维持它们的正常水平。然而，过量ROS扰乱氧化还原稳态会引起氧化应激，从而破坏蛋白质、脂质、糖类和核酸等生物大分子[1]。临床和试验研究已证实，糖尿病患者的MMP-2表达增加[14]，MMP-2在DR发病过程中发挥重要作用，而MMP-2的激活受到超氧化物的控制[15]。在高糖培养视网膜血管内皮细胞的实验中，学者发现MMP-2明胶酶活性较正常葡萄糖浓度培养的细胞升高30%～40%；MMP-2的细胞膜激活子膜型基质金属蛋白酶1(membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP)基因表达增加25%，而细胞内抑制子TIMP-2下调70%[11]。通过转染MMP-2小干扰RNA，可以明显改善高糖引起的线粒体超氧化物增多以及线粒体肿胀[11]。线粒体是细胞能量的主要来源，其主要作用是产生ATP、控制细胞代谢及调节细胞凋亡，故线粒体功能障碍严重影响细胞稳态。因此，视网膜毛细血管细胞的线粒体功能障碍可以激活细胞凋亡通路，从而在DR的发病机制中发挥重要作用[14]。

热激蛋白(heat shock protein，HSP)60是一种线粒体蛋白，其在促进蛋白质折叠和维持线粒体完整性方面发挥重要作用，如在成年小鼠心肌细胞中HSP60的缺失导致心力衰竭，并显著干扰线粒体蛋白稳态和线粒体功能；在血管平滑肌细胞中可以观察到HSP60活化激活，阻止细胞凋亡并促进受损血管的新内膜增厚[16]。在应激状态下，HSP60在胞质中累积[17]。在高糖条件下，视网膜HSP60在线粒体内的积累显著减少，在细胞质内积累显著增加，HSP60与MMP-2之间的相互作用增加。同时，高糖环境亦增加了视网膜线粒体促凋亡基因Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)的表达[11-12]。此外，HSP60还可与HSP家族的另一成员HSP70相互作用[18]，这与Bax的构象变化和线粒体释放细胞色素C的调节有关[19]。Bax和细胞色素C在线粒体上的转移受MMP-2与HSP60相互作用的控制，进一步证实了HSP60在线粒体损伤中的作用。间隙连接蛋白(connexin，Cx)43是Cx中的一员，有助于细胞间的通讯和离子的转移，在糖尿病患者的视网膜中表达下调，且MMP-2与Cx43之间的相互作用减弱[14]。在正常大鼠玻璃体内注射MMP-2后，视网膜线粒体被破坏，线粒体中的HSP60和Cx43水平降低，同时毛细血管细胞凋亡增加[14]。因此高血糖激活线粒体中的MMP-2，继而可能通过调节HSP60和Cx43破坏线粒体的完整性，致线粒体膜电位丢失、运输通道受损，Bax进入线粒体，释放细胞色素C，激活细胞凋亡机制，从而使视网膜毛细血管细胞凋亡加速，进而导致微血管通透性增加、渗漏等一系列病理过程。

此外，视网膜血管内皮细胞中葡萄糖诱导的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly-(ADP-ribose) polymerase，PARP]激活也受MMP-2的调控。MMP-2的激活可裂解细胞核PARP[20]，且由于细胞核与线粒体之间存在明显的串扰，PARP的裂解可通过线粒体途径，即通过线粒体释放凋亡诱导因子引起细胞凋亡，最终促进细胞色素C的释放[21-22]。Mohammad和Kowluru[11]的体内试验表明，通过过表达线粒体超氧化物歧化酶，调节糖尿病患者视网膜中线粒体超氧化物的积累，也可以抑制MMP-2的活性及其调节剂表达水平升高，且此结果与体外实验结果一致。

2.2增殖期促进新生血管产生 在DR发展的晚期，随着毛细血管基膜的增厚和周细胞、内皮细胞的丢失，开始出现新生血管和侧支血管，这是PDR的显著特征。缺氧时，新生血管通常起源于视网膜循环的静脉侧，最初在视盘上可见细小的血管簇。这些新血管在玻璃体中三维生长。由于这些新血管易碎，容易出血，玻璃体内可见小出血。当出现明显出血和黄斑模糊时，会突然发生严重的视力丧失。当新生血管成熟时，结缔组织发育，纤维化(瘢痕)使玻璃体对视网膜产生牵引力，这可能导致牵引力性视网膜脱离[23]。

MMP-2有助于血管生成，并涉及多种机制。如MMP降解毛细血管基膜，这是内皮细胞穿透内皮下基质和形成新管腔的必要条件；血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被认为是DR发展的主要生长因子之一[24]，维持视网膜细胞的结构和功能稳态依赖于VEGF的正常表达，但在缺氧和高血糖等病理因素的作用下，其过表达可导致血管内皮通透性增加，凋亡蛋白的抑制作用减弱，血管稳态的破坏以及视网膜新生血管的形成[25]。MMP是VEGF介导的细胞增殖和新血管形成的活跃分子[26]，VEGF能够诱导MMP表达并促进视网膜新血管形成[25]。同时，MMP还促进了结合VEGF的组织可用性[23]。研究显示，PDR患者视网膜新生血管膜MMP-2活性升高[27]。此外，PDR患者存在激活的ProMMP-2，纤维血管组织中ProMMP-2的激活被认为是其与MT1-MMP和TIMP-2的相互作用介导[28]。

细胞外基质蛋白水解被认为是病理性血管生成所必需的最早和最持久的活动之一。MMP-2(明胶酶A)和MMP-9(明胶酶B)在细胞外基质降解中起重要作用，是新生血管从视网膜逃逸并侵入玻璃体腔的必要步骤，是PDR的标志。MMP-2在神经节细胞层、内丛状层、内核层和突破内界膜的新生血管中均有表达。研究发现，与对照组相比，PDR组患者房水、玻璃体和血浆中的MMP-2水平显著升高，由此推测MMP-2可能参与调节PDR患者视网膜血管生成过程[29]。

缺氧性米勒细胞分泌的VEGF增加了血管内皮细胞MMP-2的表达及活性，从而促进PDR视网膜新生血管形成。Rodrigues等[29]研究发现：缺氧诱导因子1α在视网膜血管内皮细胞中的表达增加可以直接促进MMP-2的表达；缺氧诱导因子1α在米勒细胞中表达增加可以诱导VEGF分泌，进而引起邻近内皮细胞中MMP-2表达的增加和活性提高；缺氧诱导的内皮细胞中MMP-2的表达可通过TIMP-2的上调来平衡，而VEGF诱导的MMP-2表达不能通过TIMP-2水平的升高来平衡。低氧环境中米勒细胞分泌的VEGF和邻近内皮细胞在视网膜新生血管的MMP-2调控中存在复杂的相互作用，并确定MMP-2是治疗PDR的靶标[30]。因此，VEGF处理内皮细胞后，MMP-2活性明显升高，从而促进内皮细胞端部MMP-2的表达。值得注意的是，TIMP-2在MT1-MMP激活MMP-2中也发挥了一定作用[31]。此外，MT1-MMP本身也是一种胶原酶，其在PDR中可能独立于MMP-2在纤维血管增殖的发展中发挥直接作用[32]。

以上研究结果表明，缺氧诱导因子的稳定对于促进缺氧内皮细胞中MMP-2的表达是必要和充分的。而MMP-2的表达是由米勒细胞分泌因子诱导。研究显示，采用缺氧永生化人米勒细胞的条件培养液处理永生化人脐静脉内皮细胞后，其MMP-2信使RNA水平显著高于正常永生化人米勒细胞条件培养液处理的永生化人脐静脉内皮细胞，提示缺氧米勒细胞分泌的因子促进了内皮细胞中MMP-2的表达。

3 MMP-2抑制剂治疗DR的潜在应用

MMP在PDR患者视网膜新生血管组织和水溶液中表达水平升高[33]。研究证明，与对照者相比，无论是否接受过全视网膜光凝治疗，PDR患者MMP-2水平均升高，表明MMP-2在接受过PDR治疗的患者中也是一个治疗靶点[33]。在动物模型中，MMP的广谱药理抑制可以防止视网膜新生血管[34]。因此，以MMP-2为靶点的治疗可以成为PDR患者预防或治疗新生血管的一个重要而有效的部分。

随着以MMP-2为靶点的DR治疗进入科学家的视野，MMP-2抑制剂成为DR治疗药物研发的焦点。广谱抑制剂(如GM6001)和许多选择性小分子抑制剂因毒性、选择性差或治疗效果不佳等缺点阻碍了其发展。而针对特定MMP(如MMP-2)抑制性抗体的开发有望成为未来的治疗方法。虽然这一领域尚未引起人们的广泛关注，但个别针对单个MMP抑制性抗体的研发已经取得了显著成果[35-37]。研究发现，高效、高选择性抗MMP-9单克隆抗体GS-5745(Andecaliximab)在溃疡性结肠炎和胃癌的治疗中显示出良好疗效；GS-5745单独以及与mFOLFOX6联合应用对未经治疗的胃癌和胃食管交界腺癌患者的疗效和安全性目前正在进行Ⅲ期临床试验[38]。MMPI-1154和MMPI-1260是一种新型心肌细胞保护性小分子MMP-2抑制剂，可用于治疗急性心肌梗死[39]。MMP-2抑制剂ARP100在缺血再灌注损伤的心肌细胞中具有改善心脏收缩功能的作用[40]。此外，在视网膜母细胞瘤的Weri-1细胞中，ARP100可显著降低VEGF的表达和细胞活力[41]。随着这一领域不断取得新成果，开发一种针对MMP-2的药物并用于DR治疗的可能性显著增加。

4 小 结

目前，DR的治疗专注于疾病后期，通过暂时防止异常视网膜血管的形成来延缓视力丧失。但当前的治疗方法无法恢复受损的神经组织或100%恢复视力。DR中的视网膜损伤和新血管形成过程与糖尿病患者的高血糖环境密切相关。而保护视网膜和避免这种疾病发展主要针对细胞凋亡、超氧化物蓄积和新生血管生成。而体外和体内试验研究提供了MMP-2抑制剂作为潜在药物预防上述病理学进展的证据。因此，特异性靶向MMP-2抑制性抗体有望成为未来的治疗方法。