药物性急性肝衰竭动物模型的研究进展及其在中医药研究中的应用▲

林 镛 彭子明 冯 逢 张建玲 龙富立， 毛德文 韦艾凌，3

(1 广西中医药大学研究生学院，南宁市 530200，电子邮箱：243560015@qq.com；2 广西中医药大学第一附属医院肝病二区，南宁市 530023；3 广西中医药大学成人教育学院，南宁市 530001)

【提要】 急性肝衰竭是一种严重而复杂的肝损伤，短时间可迅速危及生命，患者生存预后差，短期死亡率高。建立合适的动物模型，对于疾病机制和治疗策略的研究具有重要意义。目前，我国中医药在急性肝衰竭的治疗方面表现出巨大潜力。本文对近年来常用的药物性急性肝衰竭动物模型及其在中医药研究中的应用做一综述，为急性肝衰竭的深入研究提供模型选择及评价参考。

急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)是由多种因素引起的短时间内发生的肝功能损害、凝血功能异常，进而出现肝脏解毒、代谢和合成等功能严重障碍和多器官功能衰竭。病理上表现为肝脏大量炎性细胞浸润和肝细胞坏死，病情进展十分迅速，病死率高达70%～80%[1-2]。目前，药物保守治疗是ALF最主要的治疗方法，但尚缺乏特效的药物。研究表明[3]，在西医治疗基础上配合中医药治疗能有效改善ALF患者的预后、减少并发症发生、缩短住院时间。本文针对目前国内外常见的药物性ALF动物模型的制备方法和评价指标等方面进行了总结，并介绍药物性ALF动物模型在中医药研究中的应用进展。

1 实验动物

目前应用于ALF造模的动物有大鼠、小鼠、兔子、犬、猪、非人灵长类(恒河猴、食蟹猴)[4-5]等，雌雄均有。

1.1 啮齿 啮齿动物在ALF模型制备中应用最为广泛，常用于药物性ALF模型的建立，大鼠品系一般以 Wistar 和 SD 为主[6-8]；小鼠以 ICR、C57BL/6j、KM在研究实验中最为多见[9-11]，也有研究用其他品系小鼠，ALF造模对小鼠品系无严格要求。

1.2 兔 可用于建造ALF模型的兔品系比较多，造模方式以手术和药物为主。手术造模可以较为直观地观察体内情况，因此是研究肝脏外科疾病的首选动物模型，适合人工肝支持系统在ALF中的应用研究[12]。

1.3 猪、犬 猪、犬ALF的造模方式以手术、化学药物为主。猪、犬作为哺乳动物在遗传和生理上与人类存在高度相似性，被越来越多的实验所采用。手术模型多用于测试各种生物型人工肝系统，化学药物模型常用于研究ALF临床机制、生化、组织病理变化等[13-16]。

1.4 猴 研究表明，非人灵长类动物肝脏发育、内环境变化与人类极其相似，其ALF模型在临床上与患者的临床特征、肝脏指标、组织病理学、影像学和寿命表现出相似的变化[17]。所以非人灵长类动物ALF模型常用于研究引发ALF的诱因或潜在的机制及新型病毒基因型试验[4-5]。

2 建模方法

常见的药物性ALF动物模型主要使用肝毒性药物建模，药物包括对乙酰氨基酚(N-acetyl-p-aminophenol,APAP)、D-氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN)、硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)、四氯化碳、刀豆球蛋白A(concanavalin A,ConA)、卡介苗等。不同的建模方法涉及不同的实验程序，每种动物模型各有优势，但同时存在一定的不足。

2.1 ALF模型的建模方法

2.1.1 APAP：(1)APAP制备模型原理。APAP是一种肝毒性很强的药物，其诱导肝衰竭机制与氧化应激、线粒体功能障碍、肝细胞坏死等有关[18]。线粒体功能障碍是APAP诱导 ALF 模型成功的主要机制，中毒剂量的APAP 可选择性地使三磷酸腺苷酶复合体中的高亲和力位点失活，从而抑制三磷酸腺苷酶活性并损伤线粒体超微结构，引起肝衰竭[19]。(2)造模方法。①啮齿动物：以750 mg/kg APAP对小鼠进行腹腔注射，约12 h造模完成[9]。②犬类：Ortega等[13]将杂种犬禁食12 h后，每90 min静脉注射500 mg/kg一次，注射后24～48 h内可发现犬出现广泛肝损伤，48 h后出现大量肝坏死，76 h犬的死亡率为100%。赵世峰等[14]采用皮下注射APAP法对杂种家犬进行干预，首次剂量为750 mg/kg，注射后9 h和24 h分别再以200 mg/kg APAP行第2、3次注射。结果显示，该方法ALF模型成功率为76.7%。③猪类：选取雌性长白猪，按250 mg/kg剂量经十二指肠给予APAP，以0.5～4 g/h的维持量将APAP血清浓度维持在300 mg/L以上，直至各指标符合ALF[15]。目前采用APAP制备非人灵长类ALF模型尚未见报道。以上文献显示APAP可用于多种动物ALF模型的建造，但中大型动物模型的建模成功率欠佳，小型动物模型的制备较为常见。

2.1.2 D-GalN：(1)D-GalN制备模型原理。D-GalN 可快速结合并消耗体内大量尿苷酸，使肝脏核酸、糖蛋白、脂糖等物质合成受抑制，进而导致酶的合成和补充受到限制，细胞器生成受阻，对肝细胞组织造成不可逆的损伤。脂多糖能刺激肝脏巨噬细胞、枯氏细胞产生肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，进而破坏血管内皮的完整性，导致肝细胞的凋亡和坏死[20-21]。D-GalN又能加强脂多糖的急性毒性，所以无论单一使用D-GalN或与脂多糖共同作用均可诱导ALF模型。(2)造模方法。① D-GalN与脂多糖共同作用造模。a小鼠：吴小红等[22]给予C57BL/6j小鼠腹腔注射200 μL 含脂多糖(2.5 mg/kg)和D-GalN(0.3 g/kg)的生理盐水溶液一次成膜。Lin 等[10]给予C57BL/6j小鼠腹腔注射脂多糖(50 μg/kg)和D-GalN(800 mg/kg)，1 次/d，连续3 d后完成造模。b大鼠：龙富立等[11]予无特定病原体级大鼠腹腔注射脂多糖(20 μg/kg)/D-GalN(600 mg/kg)，一次成模，时间为48 h；Kitazawa等[23]给予Wistar大鼠腹腔注射D-GalN(500 mg/kg)/脂多糖(50 μg/kg)3 h 后，即可建成ALF模型。c猪类：彭承宏等[16]对雌性家猪经门静脉注射0.5 g/kg D-Ga lN和1 μg/kg脂多糖一次建立猪ALF模型，4 d死亡率为83%。② D-GalN单独作用造模。a大鼠：刘芳等[24]、Zhang等[25]研究均证实按1.4 g/kg的剂量给予大鼠腹腔注射D-GalN一次后可制备成大鼠ALF模型，该模型在生化学、组织学、临床表现等方面与人类相似。b猪类：乔玲等[26]采用中国实验小型猪、郭健文等[27]采用五指山系小猪，分别经颈外静脉和耳静脉一次性按1.2 g/kg体重量D-GalN腹腔注射制备ALF模型，结果提示两种注射方法均获得满意的猪ALF模型。Wei等[28]同样通过耳静脉注射D-GalN构建猪ALF模型，但其D-GalN剂量则为1.5 g/kg。c犬类：Patzer等[29]报道使用异氟醚麻醉后经静脉给予雄性猎犬注射1.5 g/kg D-GalN可成功建立犬ALF模型，犬平均生存时间为43.7 h。d非人灵长类：Feng等[30]以食蟹猴为实验对象，按0.25 g/kg经小隐静脉注射D-GalN诱导食蟹猴ALF模型，一次成模，约72 h后其临床表现、生存时间、病理变化等方面都可呈现ALF特点。D-GalN制备模型涉及动物种类较广，制备方式多为一次成膜且其成模后动物表现与临床符合程度较高，为目前较为常用的ALF造模药物，造模方式有腹腔注射、颈静脉、耳静脉等。

2.1.3 TAA：(1)TAA制备模型原理。TAA诱导肝损伤的特点是使细胞氧化应激增加和抗氧化防御能力受损，活性氧升高促进脂质氧化产物的积累，导致细胞坏死和肝损伤；其次是TAA可以使生物体释放大量促炎性介质[白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β等]使肝损伤进一步加重[31-32]。(2)造模方法。啮齿动物：①小鼠。杨天翼[33]按200 mg/kg给予C57BL/6j小鼠腹腔注射TAA，一次成膜，ALF小鼠的病理、血液生化、死亡率均与患者相似。②大鼠。毛德文等[6]按6 mL/kg对无特定病原体级Wistar大鼠皮下注射10%TAA，24 h后重复注射同等剂量，48 h后ALF模型造模成功。张美华等[34]按200 mg/(kg·d)、250 mg/(kg·d)、350 mg/(kg·d)的剂量对无特定病原体级雄性大鼠行腹腔内注射TAA 2 d,1次/d,发现TAA致雄性大鼠ALF及其相关并发症(肝性脑病、高内毒素等)具有浓度依赖性。之后的大量研究显示，腹腔注射100 mg/kg[35]、400 mg/kg[36]、600 mg/kg[37]剂量的TAA均可诱导大鼠出现ALF，但须掌握注射的次数。TAA多用于制备龋齿类动物ALF模型，尚未发现在中大型动物及非人灵长类动物中应用的相关研究报告。其造模剂量从100～600 mg/kg均有报告，考虑与不同品系鼠类和注射次数有关，其造模剂量差异较大也导致该造模方法较少使用。

2.1.4 四氯化碳：(1)四氯化碳制备模型原理。四氯化碳进入机体经细胞色素P450激活后攻击细胞膜上的磷脂分子，并与肝细胞膜脂质和蛋白质共价结合，进而破坏肝细胞膜结构和功能，影响蛋白质代谢和Ca2+内流增加，引起肝功能损害和生化血液学指标改变[38]。(2)造模方法。在动物实验中，常通过灌胃、腹腔注射、皮下注射等给药方式给予四氯化碳制备动物ALF模型，其中腹腔注射法可以使药物直接经门静脉作用于肝脏，因此较为常用。啮齿动物：有学者按4 mL/kg剂量给SD大鼠灌胃30%四氯化碳一次诱导ALF模型，结果显示ALF大鼠的血清生化学、病理学、病死率等方面都与患者ALF相似[7-8]。猪类：Nardo等[39]对体重为28～35 kg的白色大型雌猪，按450 mg/kg剂量腹腔注射四氯化碳一次建立ALF模型，研究体外门静脉氧合作用。犬类：张日平等[40]将纯四氯化碳与大豆油按体积比1 ∶1.5配制，按0.25 mL/kg于清晨空腹注入杂种犬腹腔，前2周每周注射 1次，后5周每 4 d注射1次，7周可完成造模。还有学者采用四氯化碳联合其他药物或联合肝缺血制备ALF模型。如张慧芸等[41]采用四氯化碳联合D-GalN和脂多糖制备BALB/C小鼠慢加ALF模型；Yuasa等[42]在经门静脉注射四氯化碳的同时联合肝缺血建立长白雌猪ALF模型。四氯化碳构建ALF动物模型的方法已较为成熟，其可单独诱导也可联合其他药物共同诱导ALF，考虑到时效性和模型相似性，目前主要以小型动物造模为主。

2.1.5 ConA：(1)ConA制备模型原理。ConA是一种T细胞丝裂原，能激活T淋巴细胞。注射ConA后动物肝实质可见大量淋巴细胞浸润，主要以CD4+、TNF-α、IL-6为主，而后导致肝组织坏死，门静脉充血及凝血。动物实验中常用ConA诱导建立肝脏疾病模型，该方法能较好地模拟人类病毒性肝炎、免疫性肝病等[43]。(2)造模方法。王友强[44]和Guo等[45]经C57BL/6j小鼠尾静脉注射20 mg/kg ConA一次，约6 h内可观察到肝损害及炎症反应，符合ALF表现；朱鏐娈等[46]也发现一次性静脉注射15 mg/kg ConA 10 h后可建成C57BL/6j小鼠ALF相似模型；Li等[47]在研究调节性T细胞和Th17时发现，采用12 mg/kg剂量的ConA建立的C57BL/6j成年小鼠ALF模型也同样符合ALF临床表现症状。

2.1.6 卡介苗：(1)卡介苗制备模型原理。动物实验中，卡介苗常与脂多糖联合诱导ALF模型，机制是卡介苗可使库普弗细胞、巨噬细胞、T细胞等单核细胞浸润，而脂多糖可以激活单核细胞引起炎症反应，两者共同作用可以导致急性大面积肝坏死[48]。(2)造模方法。Yang等[49]先经尾静脉给予雄性昆明品系小鼠注射卡介苗 2.5 mg(活菌，卡介苗溶于2 mL生理盐水中)，使小鼠致敏，10 d后再经尾静脉注射10 mg/只脂多糖，约2 h后可诱导小鼠出现ALF。

2.2 ALF模型评价 Terblanche等[50]于1991年提出，理想的ALF动物模型应具备以下特点：(1)有可逆性；(2)模型有可重复性；(3)动物死于ALF；(4)有适当治疗窗口期；(5)如是大型动物应连续监测和建立体外循环，以方便指导临床应用和效果评价；(6)对环境、实验人员危害最小。2000年Fourneau等[51]和Newsome等[52]又做了三点补充：(1)动物模型须有意识，可评估肝性脑病；(2)生理代谢与人相似；(3)符合伦理道德要求。实际研究中，良好的ALF模型其生理、病理、血清等指标需符合Terblanche和 Hickman标准[53]。但目前的动物研究中，均符合上述标准的动物模型较少见，每种模型都有各自优势特点及局限性。如动物种类的选择上，啮齿类小型ALF动物模型具有造模方式简便、重复性高、费用低等优势，能很好地复制临床ALF症状，但其生理代谢与患者存在差异，但行为意识难以评估，常用于疾病机制及药物治疗的研究；兔、犬、猪中大型动物模型与ALF患者的相似程度更高，成膜有较长的治疗窗口期，具有一定的神经系统表现，能够连续监测和建立体外循环，常用于检验新型生物人工肝功能或新药或新治疗方法的疗效评估，但其价格较高，建模的条件要求较为严格；非人灵长类动物较少用于建立ALF模型。药物的选择上，以D-GalN单独造模、D-GalN联合脂多糖造模、四氯化碳单独造模最为常见，这些药物致ALF的原理与临床ALF发病机制相似，而且成膜用时较短，用药方法简单易行且重复性较高。而随着科学技术的发展，药物结合手术造模、ConA造模等新型造模方式相继出现，在不久的将来，ALF的动物模型将更加贴近临床。

3 药物诱导ALF动物模型在中医药研究中的应用

ALF起病急，病情凶险，病死率高达80%，但ALF的发病机制尚未明确，尚缺乏特效的治疗手段，药物保守治疗及人工肝治疗仍是目前治疗ALF的主要方法。研究表明在西医治疗基础上配合中医疗法治疗可以有效改善患者的临床症状和预后[54]。在ALF动物模型的基础上，探讨中医的治疗方案可为中医治疗ALF的研究提供实验依据。研究显示，单味中药、复方药及中成药等对各种ALF动物模型均有治疗作用[55-56]。治疗机制涉及代谢组学、蛋白质组学、基因组学、肠道菌群、免疫等各方面。还有研究显示，穴位注射可通过刺激经络腧穴达到利胆退黄、增强免疫作用，从而促进肝功能的恢复，穴位可选用调节肝胆、脾胃经的腧穴，如肝俞、中都、日月、脾俞、足三里、期门等[57]。同样的还有中药提取物和中药化合物，例如黄旭等[58]所采用的石见穿多糖能有效保护由内毒素/D-GalN诱导的ALF小鼠肝细胞损害，降低肝氧化应激和抑制肝炎症反应；寇小妮等[59]发现臭牡丹大黄提取素可以减轻ALF小鼠肝细胞坏死和凋亡，其机制可能与抑制小鼠ERS信号分子有关；毛云等[60]则是通过人参皂苷化合物诱导骨髓间充质干细胞的分化合成从而改善ALF大鼠肝功能,机制可能与加速肝脏再生有关。

4 小 结

ALF的发病机制复杂，良好的ALF动物模型可为ALF的机制研究提供实验依据，但目前各种肝损伤模型还存在缺陷，尚难以完全复制人体肝损伤的病理生理过程。制备更全面、更完善的ALF动物模型仍是将来研究的重点，今后可考虑多种造模方法联合应用，扬长避短，建立稳定且符合贴近临床的动物模型。同时，中医治疗ALF的研究尚处于起步阶段，治疗方法及疗效的评估尚未规范统一，今后仍需充分利用ALF动物模型，从“证候”角度研究中医辨证治疗ALF的机制，为中西医结合治疗ALF提供新的思路。