腹泻犊牛大肠埃希菌的分离鉴定与药敏试验

张 成

山东省邹平市长山镇畜牧兽医站，山东滨州256207

犊牛大肠杆菌性腹泻为一类兽医临床中较为常见的疾病，半月以内的新生犊牛为发生此病的主要群体，春冬季为好发季节，死亡率高、发病急、病程短。依照犊牛的具体临床表现可分为3 个类型，即肠炎型、肠毒血型和败血型。如果未能及时对犊牛开展治疗，数日内即可死亡。

很多犊牛于10～14日龄后发生疾病，患病后体温会升高到40～41 ℃，24 h 后会排出胶冻样黄色粪便，内部含有大量血丝以及黏液。在病期延长时，病畜可继发性出现腕关节和副关节肿大，有的病畜还会表现出肺炎以及支气管炎的症状[1]。

1 材料与方法

1.1 材 料

1）试验选择2020年3月25日某养殖场内发病犊牛尸体组织为病原来源，取其淋巴结、脾脏、肝脏、心脏组织以及血液。

2）培养基种类为生化鉴定培养基、鲜血平板、三糖铁琼脂培养基、SS 培养基与LB 以及麦康凯培养基。

3）生化试剂种类：革兰氏染色剂中包含碘片、浓度为95%乙醇、结晶分析纯化学试剂、草酸铵、碱性复红以及碘化钾。

4）生化鉴定试剂：硫化氢、无水乙醇、甲基红、氢氧化钾、硫酸钠、硫化亚铁、α-萘酚、靛基质、蔗糖、甘露醇、麦芽乳糖以及葡萄糖。

5）药敏试验：药敏纸片具体为土霉素、恩诺沙星、硫酸链霉素、卡那霉素、庆大霉素等。

6）试验动物：10 只雄性小白鼠，体重为18～20 g。

1.2 研究方法

1）流行病学调查。工作人员全面探究饲养场当前管理情况、消毒情况、当地天气、疾病具体发病过程、犊牛死亡情况、发病情况、具体症状以及解剖学病理改变，目的在于深度了解疾病的发生特点。

2）病料具体采集过程以及镜检过程。依照无菌操作原则，收集病牛尸体淋巴结、脾脏、肝脏、心血组织，同时完成涂片工作。在此之后实施染色以及镜检。

3）大肠埃希菌分离以及培养。将以上组织分别接种在LB 肉汤内实现培养，环境温度为37 ℃，接种时间为24 h，然后实施革兰氏染色与镜检观察。

4）大肠埃希菌纯化。开展细菌分离培养工作，把脾脏、肝脏等组织分别接种在新鲜兔血营养琼脂平板中，每类脏器接种平板为4 份。其中，2 份实施普通需氧菌培养，另外2 份实施厌氧菌培养，将其放入温度为37 ℃的恒温箱中24 h 查看结果。针对于分离出的细菌开展革兰氏染色与镜检，然后将细菌进行纯培养，将纯培养物接种在麦康凯培养基、三铁斜面穿刺培养基以及LB 培养基内，于37 ℃环境下需氧培养24 h，在此之后查看最终结果。

5）生化鉴定步骤。糖分解试验：取用分离菌24 h纯培养物，接种在麦芽甘露醇培养基、乳糖培养基、葡萄糖培养基中，培养处理24 h，温度为37 ℃，查看结果。MR/VP 试验过程择取分离菌培养物，将其接种到葡萄糖蛋白胨水溶液内，培养处理24～48 h，温度为37 ℃，并在其中添加指示剂[2]。

6）硝酸盐还原。试验取用分离纯培养物质接种到硝酸盐培养基内，培养处理24 h，环境温度为37 ℃，加入试剂乙以及试剂甲。如果在0.5 min 内转为红色，即可视为阳性；如果没有颜色，则应增加少量锌粒，若出现红色为阴性试验。

7）药敏试验。本试验应用药敏纸片法开展药敏试验工作，常用种类为四环素类以及青霉素类药物。

8）动物试验。本试验实施动物致病性试验，将分离取得的大肠杆菌接种自营养肉汤内，培养10 h，温度环境设定为37 ℃。取用培养液接种试验动物，同时设立对照组。

9）溶血试验。本试验应用平板法对分离溶血的特性加以测定，工作人员把大肠杆菌菌种接种到浓度为5% LB 平板内培养处理48 h，温度设定为37 ℃，查看溶血情况，若菌落四周出现溶血圈，则判定为阳性结果。

2 结果与分析

通过开展动物试验病原菌分离鉴定试验，观察病理改变、查看临床症状以及实施流行病调查，结果表明：该养殖场内犊牛死亡原因为大肠杆菌感染所致。

经药敏试验结果证实：大肠杆菌菌株针对于各类药物敏感性存在较大差异。其对于庆大霉素以及硫酸链霉素敏感性强，对于四环素以及新霉素耐药[3]。

3 讨 论

当前，学术界已确定共计3 类大肠杆菌会导致犊牛腹泻。

1）产热较为稳定或者热不稳定的肠毒素大肠杆菌，其也被称为产肠毒素性大肠杆菌。

2）大肠杆菌定植于小肠黏膜，但不会生成复杂肠毒素。上述菌株能以特异性的方式吸附于动物肠腔表面肠细胞中，常于杯状凹陷内或者胞浆突起之上。大肠埃希菌吸附于肠上皮表面，经常引发微绒毛脱落。学术界将此类病变称之为吸附脱落病理改变。

3）大肠杆菌定植于动物大肠表面所引发的轻微痢疾，这种情况也会导致AE 病变。上述菌株会引发大肠出血，所以其也被称为肠出血性大肠杆菌。某些肠出血性大肠杆菌和肠致病性大肠杆菌会产生一类毒素，能够消灭体外培养的Vero 细胞，其可被称为类志贺毒素或者Vero 细胞毒素。这种毒素不会引发AE病变，但会参加到相关致病过程中。

如果犊牛便内带血，尤其是便内无分离的沙门氏菌以及隐孢子虫状况下，若发现大肠以及小肠黏膜有关大肠杆菌，就可以推断其为肠致病性大肠杆菌。

本组试验结果表明：该养殖场内犊牛死亡原因为大肠杆菌感染所致。药敏试验结果证实：菌株对于庆大霉素以及硫酸链霉素敏感性强，对四环素和新霉素耐药，出现这一情况的原因和长期盲目用药有关。基于此，建议相关人员在治疗犊牛大肠杆菌病过程中，有必要定期轮换用药，最好是先实施药敏试验，择取敏感药物开展有效治疗，以免造成经济损失。

要想预防此类疾病发生，务必要做好综合化防治举措，降低各类应激因素出现率。强化对于牛犊的饲养管理力度，做好牛舍通风，落实各项卫生保健举措。另外值得说明的是，饲养主也有必要增加清洗犊牛饮奶器具的频次。