纳米药物分析技术方法研究新进展*

靳雅丽，杨德智，杨世颖，张丽，吕扬

(北京协和医学院中国医学科学院药物研究所药物晶型研究中心，晶型药物研究北京市重点实验室，北京 100050)

纳米技术在生物医药领域已获得广泛的关注，目前，纳米药物可分为两类：纳米颗粒药物，即药物本身纳米化，也就是采用一定手段将药物制成纳米尺寸，如混悬剂、片剂、胶囊剂等；纳米载体药物，即将药物载入纳米载体中，借助纳米载体的效应更好地发挥疗效，如脂质体、纳米球、纳米囊等[1]。与传统药物比较，纳米药物具有很多优势：可以改变药物性质，增加难溶药物溶解度；降低药物循环过程中的降解；将药物富集于预定作用部位，在增强药效的同时降低副作用[2]；此外，纳米载体在药物递送系统的运用可以减弱或消除生物屏障对药物作用的限制，为疾病诊断和治疗及疾病进展监测提供新的技术方法[3-4]。

许多纳米药物正处于向临床应用转化的阶段，全球市场趋势表明该领域在未来几年将强劲增长[5]。纳米药物向临床的转化和随后的商业化需要建立新的分析标准或对现有标准进行修正，以确保此类产品的安全性和有效性[5]。另一方面，纳米载体是复杂的系统，其制剂的物理化学性质决定其治疗功效和安全性[6]。国际药品监管计划的成员[5，7-8]对纳米药物分析标椎已达成共识，认为应包括粒度分布(particle size distribution，PSD)、形貌、化学组成、包封率或载药量和药物释放动力学等理化参数，同时认为这些质量参数是评估纳米药物制剂的质量及临床疗效和安全性的关键因素。当前已有多种标准化方法来表征纳米药物关键的理化性质及其对医用纳米颗粒生物系统的影响，但遗憾的是通常不适用于复杂和创新纳米制剂[5]，监管机构需要建立一套标准操作规程来指导纳米药物的分析检测，因此，有必要综述当前纳米药物分析方法，以提高纳米药物质量分析的整体水平。目前，对纳米药物的分析集中在结构和性质的表征，笔者在本文对其粒度及PSD、形貌、包封率或载药量分析方法进行简单阐述外，还介绍几种特殊的纳米药物分析方法。

1 粒度及粒度分布分析

粒度及PSD测定是纳米药物表征的最重要技术之一，扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)[9-11]用于纳米药物的表面分析和尺寸测量，是测量粒径、PSD、聚集程度、分散性的有效方法。与SEM相比，透射电镜(transmission electron microscope，TEM)[9-11]具有更高的分辨率，是纳米药物表征不可缺少的工具。除此之外，动态光散射技术(dynamic light scattering，DLS)[12]是应用最广泛的测量粒度分布的分析方法，具有简便、快速、重复性强等优点，主要用来观测纳米粒子的尺寸和表面电荷，但是分辨率低，不适合测量非球形的、混杂且不均匀的粒子，检测结果会受环境中尘土以及样品中聚集粒子的影响。DLS能够对一些基于蛋白、多糖脂质体的纳米材料进行表征，同时也常应用于一些合成的聚合物纳米材料和于悬浮液中纳米颗粒的粒径表征[12]。王秋月等[13]采用DLS 快速、准确地完成靶向四氧化三铁磁性纳米药物载体的表征。此外，分析性超速离心(analytical ultracentrifugation，AUC)可以高精度地研究粒径分布，其独特功能在于无需进行复杂的样品制备即可分析出准确的粒径数据，在纳米药物产品开发和质量控制方面有广阔的应用前景[14]。

由于尺寸测量方法的固有局限性，纳米颗粒多元分散体的PSD评估是一项艰巨的任务[15]。纳米粒子跟踪分析(nanoparticle tracking analysis，NTA)、可调电阻脉冲感测(tunable resistive pulse sensing，TRPS)和非对称流场流分离结合多角度光散射(asymmetric flow field flow fractionation-multi-angle light scatter，AF4-MALS)可以解析纳米颗粒多元样品的粒径分布[15-17]。

随着纳米技术在医药领域的应用越来越广泛，纳米药物也趋于复杂化。每种测量方式都有其优势和劣势，没有一种技术能够测量在所有条件下的粒径分布。所以，CAPUTO等[18]建立一种低分辨率结合高分辨率方法测量PSD和稳定性的正交测量方法：首先用简单快速的分析方法来确定样品的完整性；接着结合两种或多种高分辨率的分析方法来观察颗粒的形状和结构以及最终测量颗粒浓度；而当纳米药物处于复杂的生物介质中时，由于纳米药物和生物介质均不同，纳米药物的安全有效性也会变化大，所以建议采用更高分辨率的分析方法。CAPUTO等[19]采用非对称流场流分离技术结合多角度光散射和动态光散射技术(asymmetric flow field flow fractionation-multiangle light scattering-dynamic light scattering，AF4-MALS-DLS)，用于表征基于脂质体纳米颗粒的理化性质，结果显示该技术能够以高分辨率测量脂质体的PSD，准确反映制造过程中所引起的批次间差异和血浆中蛋白质引起的PSD变化，避免DLS分析可能导致的结果误差。该技术在合成优化、质量控制和监测有机纳米颗粒系统稳定性上具有优势。

纳米疫苗的粒径和性状对其疗效起着重要的作用，KLEIN等[6]通过DLS和非对称流场流分离技术结合紫外检测器和多角度光散射技术(asymmetric flow field flow fractionation-UV-vis detector-multiangle light scattering，AF4-UV-MALS)对纳米疫苗进行分析，结果显示DLS可以作为中试生产工厂的质量控制技术。而AF4在测定粒度、PSD的同时还能确定纳米颗粒的形状变化及对游离活性成分进行定量分析。通过DLS和AF4-UV-MALS方法得到的批次间差异低于20%，表明此方法具有很高的可重复性。

纳米药物尺寸会影响药物的体内分布、细胞摄取，进而影响疗效，一般来说，纳米药物粒径越小溶解性越好。但是，太小的粒径尺寸也是不可取的。若纳米颗粒太小，制备的难度大大增加，也不利于对纳米药物进行表征；若颗粒太大，容易沉淀且分散不均匀，难以被细胞摄取。所以要根据具体的情况来选择合适的粒径大小，例如根据肿瘤细胞与健康细胞的特点，抗肿瘤纳米药物的最佳尺寸可能是50 nm，但是仍有待进一步的研究[20]。

2 形貌成像分析

微粒形貌成像分析是表征纳米材料的另一个重要的技术指标，常用方法有电子显微镜，包括TEM、SEM和原子力显微镜(atomic force microscope，AFM)等[12]。例如，TEM已被用于不同条件下的乳蛋白纳米管、血清白蛋白纳米粒子以及淀粉基纳米粒子的成像表征[12]。AFM是一种方便、准确、快速的技术，在纳米级别生物样品的成像分析方面很有潜力，可以用来分析粒径大小，尤其可以用来测量纳米材料的表面厚度[12]。BORCAN等[21]使用SEM来确定聚氨酯纳米载体(polyurethane，PU)样品的结构特征，使用小角中子散射法(small angle neutron scattering，SANS)确定PU微粒的纹理属性。SANS提供样品体积中纳米级孔径特征信息，尤其是有关PU基质-孔界面的信息。

X射线散射是一种结构表征的工具，它在实时和真实的样品环境下实时检测材料的能力非常独特，研究人员可以使用互补的小角度X射线散射(small angle X-ray scattering，SAXS)和广角X射线散射(wide angle X-ray scattering，WAXS)了解纳米和埃米尺度粒子的形貌[22]。除此之外，同步辐射X射线纳米成像技术能够提供图像数据，利用X 射线成像技术可以无损地得到纳米颗粒团聚体三维结构信息，可以直观而有效地反映样品的形貌信息[23]。

纳米药物颗粒的形貌会影响药物在体内的循环、分布、细胞摄取和释放，表面粗糙的纳米颗粒更易被细胞摄取，主要是因为纳米级粗糙程度会降低粒子与细胞膜的排斥作用[24]。

3 包封率或载药量分析

纳米药物分析的另一个主要参数是通过测定游离或者结合的药物含量以计算包封率或载药量。总药物含量的测定通常基于对纳米药物的破坏，如采用冷冻干燥和加入表面活性剂或有机溶剂等，再使用高效液相色谱(HPLC)和适当的检测器(紫外可见或荧光)对药物或活性成分进行定量[5]。对不同的纳米药物来说，采用的HPLC方法也不同。

通常，测量方法首先通过分离步骤：微柱离心、滤膜法、超滤、超速离心、固相萃取、分子排阻、AF4和液相色谱法等，然后再采用多种检测技术：紫外-可见光谱、荧光、气溶胶检测器、质谱等进行分析[5，25-26]。例如，魏曼等[25]采用微柱离心-HPLC法测定脂质体纳米粒的包封率，结果显示该方法具有较好的适用性，能准确测定包封率。ZHANG等[26]开发一种测定纳米囊包封率的简便方法，先通过分离步骤：超滤、透析或离心，再采用蛋白定量分析试剂盒测定包封率，结果显示该方法可以快速、准确地测定纳米囊的包封率。这类方法的缺点在于过滤装置或离心管可能会吸附被测物质，稀释时可能会引起药物释放，导致测量结果有误差。测定包封率可以采用直接法或间接法，前者直接测定纳米粒的药物含量，后者通过测定游离药物含量间接计算包封率。采用直接法测定结果可能会受杂质干扰。而间接法通过测定游离药物的量避免了脂质成分的影响，不必进行复杂的样品前处理。这两种方法各有优缺点，要根据药物的性质以及分离方法的特点选择合适的分析方法。例如，若分离纯化过程导致游离药物被稀释而难以测定则选用直接法。

除此之外，有的分析方法可以不采取前处理的方法直接测定包封率，例如微分极谱脉冲法[27]、微分扫描量热法[28]以及显微镜法[29]。此类方法具有快速、简便的优点，但是其精密度不如传统方法，结果分析也比传统方法复杂，应用局限性比较大。但是，针对不同类型的创新型纳米药物特点，科研人员需要开发出更加便捷、准确的包封率测定方法与技术。

4 其他纳米药物分析方法

随着纳米药物研究的不断深入，为了达到更好的临床疗效，制备获得的纳米药物种类更加复杂，利用智能纳米药物治疗疾病成为药学领域的热点，许多创新型纳米药物、复杂纳米药物需要特殊的分析方法来对其进行表征。

4.11H-NMR 测定PEG接枝率 为了防止纳米药物刚进入人体就被免疫细胞吞噬或者被蛋白质非特异性吸附，经常在纳米颗粒表面接枝聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)，对于此类药物来说接枝率可以反映纳米药物质量的优劣[30]。然而，由于缺乏可行的表征方法，导致很多体内研究并未表征PEG在纳米颗粒上的接枝密度，这使得研究结果难以评估[31]。

LU等[31]采用多洛伦兹分裂算法将游离PEG的NMR信号与接枝的NMR信号区分开，从而可以使用1H-NMR对接枝过程进行原位监测。该方法的优点是不受PEG末端官能团类型、表面化学性质、纳米粒子或组成的限制，它还为体内生物学和生物医学研究提供表征纳米颗粒上PEG接枝密度的关键和标准指南。

4.2同步辐射技术分析纳米药物分布 由于高分子纳米药物的细胞吸收是纳米医学领域的热门话题，因此如何检测细胞中纳米药物的技术在研究其治疗作用方面起着关键作用。PASCOLO等[32]采用基于同步辐射的傅里叶变换红外光谱(synchrotron radiation-based fourier transform infrared spectroscopy，SR-FTIR)和基于同步辐射的X射线荧光显微镜(synchrotron radiation-based X-ray fluorescence，SR-XRF)研究体外聚乳酸-羟基乙酸共聚物[Poly(lactic-co-glycolic Acid)，PLGA]纳米粒子与细胞间的相互作用，结果显示，SR-FTIR和SR-XRF技术可能是追踪PLGA 纳米粒子在细胞内踪迹的有力工具。

4.3荧光成像技术检测纳米载体 纳米颗粒作为载体可以有效透过皮肤上皮角质层这一优势可应用于治疗皮肤病。研究纳米载体对药物渗透性的影响，需要使用可有效分析形态、药物载体、运输过程的分析工具。ALEXIEV等[4]采用荧光寿命成像显微镜(fluorescence lifetime imaging microscopy，FLIM)研究皮肤组织与纳米载体的相互作用。结果表明，FLIM可以区分目标分子和荧光标记的纳米载体，在自体荧光组织的背景下，也提供局部纳米颗粒的环境及其与其他生物分子的相互作用。因此，FLIM显示了优于其他基于强度显微技术的优势。

5 结束语

纳米药物所具有的优越特性预示着其在临床疾病治疗中具有十分广泛的应用前景，随着研究的不断深入，也为疾病治疗提供新的方法和思路。同时，必然伴随着分析方法的不断完善，甚至理念创新，由此出现许多高精度、高灵敏度的纳米药物分析方法，例如多种方法联用测量PSD、细胞内纳米药物分析、同步辐射技术应用于纳米分析技术等。但是纳米药物的快速研究与开发，使纳米制剂更加复杂，必将给药学人员带来巨大的研究机遇，纳米药物体内、体外的实时在线分析检测、对创新纳米载体的表征及采用多种方法联用实现纳米药物快速便捷的分析检测是未来药学人员面临的挑战。此外，随着工程纳米材料在科学技术中的快速发展和大量应用，必须仔细考虑其对环境、健康和安全的影响[33]，也需要建立合适的分析方法来对其进行监测。