新型冠状病毒核酸检测“假阴性”可能因素探析

廖远泉（安徽省泾县医院检验科，安徽 泾县 242500）

我国学者率先检测发现并报道了一种新型冠状病毒[1]。2020年1月30日WHO建议将该新发现病毒命名为2019新型冠状病毒（new coronavirus，2019-nCoV）。2月11日，国际病毒分类委员会将其命名为 SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），WHO将其感染所致的肺炎命名为COVID-19（coronavirus disease 2019）[2]。流行病学研究提示，SARS-CoV-2已经在人际间广泛传播[3]。SARS-CoV-2 可经呼吸道飞沫、密切接触传播，传染源主要是 SARS-CoV-2 的感染者和病毒携带者[4]。SARS-CoV-2感染所导致的COVID-19已在世界许多国家/地区呈现广泛流行态势，是一种全球流行病（pandemic）。鉴于COVID-19是一种新发的感染性疾病，对SARS-CoV-2感染者早期明确诊断、阻断疫情扩散、控制发生新的感染十分重要。但临床实验诊断中SARS-CoV-2核酸检测假阴性问题时有发生，这对于病原体分子生物学核酸检测的准确性提出了更高的要求。文章就影响其实验诊断核酸检测“假阴性”可能的因素进行探析。

1 SARS-CoV-2感染的实验室病原学检测

SARS-CoV-2感染病原学检测技术主要有SARSCoV-2的细胞培养及其基因测序、核酸检测等。我国学者[1]发现的SARS-CoV-2即是将肺炎患者的支气管肺泡灌洗液接种到人类气道上皮细胞中进行培养、分离。采用透射电镜技术观察并初步描述了病毒特异性细胞病变及其病毒颗粒形态，并成功地对培养物的蛋白组分全基因组进行了测序、检测。虽然基因组测序诊断COVID-19具有很高的准确度，但测序仪器昂贵，且多数病毒的细胞培养出现病变需要5～10 d，培养的周期长、敏感度较低且不易观察培养结果，不适用于临床快速诊断以及大批量的检测。因此病毒培养与基因组测序适宜于病毒感染性疾病的实验研究，不宜作为SARS-CoV-2感染临床检验的首选诊断手段。

核酸检测是目前SARS-CoV-2感染的主要实验诊断方法。现已建立的SARS-CoV-2特异性核酸检测技术其病毒目标片段是病毒基因组开放性读码框 ORF1ab、N基因或E基因保守区域进行引物设计。临床主要采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、以及在该检测技术基础上优化的新的检测技术，如实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）或反转录-聚合酶链式反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）。SARS-CoV-2的基因组为单链正RNA（+ss RNA），因此RNA基因组必须先通过反转录酶合成互补的cDNA链，再以cDNA链为基础进行PCR扩增。RT-PCR是RNA反转录与cDNA聚合酶联反应相结合的新技术。采用RT-PCR检测感染者标本（鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及粪便等）是否含有SARS-CoV-2特异性的RNA序列，可对COVID-19进行早期病原学诊断。进行核酸扩增前需对样本进行病毒灭活（56℃孵育30 min后加入蛋白酶K或试剂盒附加的核酸提取裂解液）。执行此操作的实验室人员须采用三级生物安全防护。与普通PCR相比，RT-PCR通过反转录酶合成互补的cDNA链，再以cDNA链为基础进行PCR扩增。同时，利用信号实时监测 PCR 反应过程中每一个循环扩增产物量的变化，可以对初始模板量进行定量检测分析，具有灵敏、特异、准确、快捷且重复性好等诸多优势，在国内外已经广泛应用于多种病毒感染的实验室检测[5-6]。其试验原理是以荧光共振能量转移原理为基础。根据荧光探针发光基团所发出的荧光强度与PCR产物的量呈对应关系，只要对荧光信号进行“实时”检测并获得未知样本的Ct值，即可从标准曲线计算出该样本的起始拷贝数。目前我国已批准上市的SARS-CoV-2检测试剂盒也以RT-PCR技术为主。

2 SARS-CoV-2核酸检测“假阴性”可能的影响因素

PCR反应能够检测不同样品中SARS-CoV-2的基因物质，具有很高的特异度，但是敏感度较低易导致出现假阴性反应的实验结果。所以，检测呈阴性并不能排除患者中有 SARS-CoV-2的存在。而且，由于SARSCoV-2是一种新发现的病毒，目前尚未建立完善的实验室质量控制体系，而样品被污染也有可能导致假阳性反应。假阳性反应的影响因素主要来源于核酸污染、非特异性扩增或因为基线（baseline）设置不当而致误读实验结果。这已经是核酸检测导致假阳性的共识问题，本文不予赘述。

对SARS-CoV-2感染所导致的COVID-19疫情，我国实验诊断主要采用的是核酸检测技术。但是，受病毒感染机制影响，不同组织来源的 SARS-CoV-2载荷差异较大，已经有多地、多次相继报道出现有核酸检测“假阴性”的案例，尤其是有的病例在不同时间、连续检测 5 次均呈阴性反应，可再检测时又由阴性转呈阳性反应[7-8]，这对临床诊断COVID-19及其疫情控制带来种种不确定的因素及影响。可能造成核酸检测假阴性反应的影响因素主要有病原学、样本采集、核酸提取、试剂盒质量等多个环节。

2.1 病原学因素与病毒核酸的检测

SARS-CoV-2是单链 RNA 病毒，在其传播过程中往往发生变异。为了能够尽早明确诊断COVID-19，临床现已应用的核酸检测试剂尚缺乏大样本的临床验证，如果被检测病毒的引物设计区域已经发生突变，即可能直接导致检测结果的假阴性。

2.2 样本因素与病毒核酸的检测

SARS-CoV-2感染者若已出现临床症状或肺部 CT改变，那么核酸检测样本首选下呼吸道样本（如深咳痰液、灌洗液等）。而在感染者不同病程中，采取上呼吸道样本（如鼻咽拭子）也能检出病毒核酸。但是，临床上由于多数感染者表现为咳痰困难，取下呼吸道灌洗液样本的操作具有很大的生物安全风险，故临床多采集鼻咽拭子或咽拭子样本, 而拭子样本采用RT-PCR检测的阳性检出率仅有30%～50%[9]，无法避免假阴性的检测结果，因此必须进行多次采样检测或结合其他样本的检测结果以明确临床诊断。相关专家共识指出应采集感染者发病3 d内的样本，但多数感染者潜伏期为2～7 d，可能绝大多数感染者在就诊时病程已经迁延了数天或数周（COVID-19潜伏期长达14 d，罕见病例甚至于长达29 d），并不能确定样本采集时是否为样本检测的最佳时段，亦不能确认样本内病毒载量是否仍然处在方法学容许的最佳检测范围[10]。

根据临床对213名COVID-19确诊病例的866份样本检测结果的分析提示，发病后0～7 d采集的痰液、鼻拭子、咽拭子这三种类型样本核酸检测阳性率为60%。但随着病程发展，这三种类型样本阳性率均逐渐降低。因此，样本采集及检测应该在发病后的0～7 d进行。样本除了肺泡灌洗液在8～14 d患者组的阳性率可达 100%，痰液样本在各个不同检测时间段的阳性率都高于其他实验观察组，且鼻拭子样本的阳性检出率高于咽拭子样本[10-11]。痰样本的病毒核酸含量高于咽拭子标本（第六版指南建议为痰标本）[4]。研究显示SARS-CoV-2多趋向于与肺泡上皮细胞结合，主要感染下呼吸道甚至肺部，提示肺泡灌洗液或纤维支气管镜检刷取物是较好的样本选择[9,12]。粪便是患者诊疗过程中理想的样本，核酸检出的持续时间普遍较呼吸道样本更长，同时粪便中SARS-CoV-2核酸阳性与感染者的疾病发展进程具有重要的相关性，可以作为对患者的疗效评估和出院标准的一种重要检测指标。此外，研究发现附有病毒保存液的植绒拭子的核酸检出率明显高于普通棉拭子的核酸检出率（P＜0.05），普通棉签拭子即使可以检出, 其阳性Ct值也明显大于植绒拭子。一般认为，对需要气管切开、进行呼吸机抢救的患者可首先考虑采集下呼吸道标本，对于轻症患者可采集痰液标本，也可采集鼻咽、口咽等上呼吸道标本。

2.3 病毒核酸不同提取方法与病毒核酸的检测

RT-PCR检测的影响因素较多，如标本核酸提取或纯化过程出现的扩增反应抑制物、扩增仪器孔间温度差异等，或实验操作技术要求较高，操作不规范可导致核酸提取效率与纯度较低。当前常用的核酸提取方法主要有煮沸裂解法、柱提法和磁珠法（其又分手工磁珠法、自动机器磁珠法）等，但以柱提法和磁珠法为常用。

有学者对58例已确诊患者的原始样本（均为带有病毒保存液的咽拭子）分别采用离心柱法及磁珠法进行病毒核酸提取后，PCR检测结果的Ct值差异无统计学意义[9]（P＞0.05）。但不同的研究者应用柱提法和磁珠法的提取效果的评价与结论却并不一致。亦有研究表明，手工磁珠法和机器磁珠法两者有效检出率一致，两方法间比较，手工磁珠提取病毒核酸效率最高，但步骤繁琐，要求操作人员技术熟练[13]。手工磁珠提取需时10 min，且可以在60℃环境、同时孵育与振荡，即可充分促进病毒核酸的裂解释放。而自动机器磁珠提取法需时30 min，通常是在室温下进行病毒核酸的裂解释放。且手工磁珠提取试剂是专一用于 RNA 的提取试剂，优化效果更好。此外，浓缩一步法优于普通一步法，两者均能直接裂解释放病毒核酸，但都未能对核酸进行提纯，对于复杂标本的抗干扰能力较弱。提示对核酸提取时避免使用快速一步法，以减少可能出现的漏诊或者假阴性。

2.4 不同检测试剂与病毒核酸的检测

在突发的公共卫生事件情况下，为了及时明确诊断的需要，可能有的检测试剂盒RNA质量参差不齐、某些试剂盒引物设计的位点尚有待优化。

郭元元等[14]对6种国产SARS-CoV-2核酸检测试剂盒的检测性能进行了分析，结果表明有的患者病毒核酸显示弱阳性反应可能不易被检出，不同试剂的检测结果亦存在一定的差异。在SARS-CoV-2感染早期，病毒复制数量往往低于RT-PCR检测阈值，出现的假阴性反应在所难免。为保证达到低水平病毒核酸检测阈值的要求，实验室在使用某种新试剂前，或更换新的试剂批号时，均应做相应的检测试剂性能的验证，以保证实验室的检测质量要求。同时，有必要采用 2种不同的试剂平行检测以避免漏检。当然，这无疑会增加检测的成本。此外，不同厂家试剂盒有其具体的实验设计参数及其技术要求，试剂盒与实验仪器的匹配性与感染者核酸检测结果的准确性密切相关，因此，不同的实验室应选择与本实验室RT-PCR仪器检测技术要求匹配相一致的检测试剂盒。

2.5 SARS-CoV-2核酸检测结果分析与解读

国家卫生健康委员会关于《新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南》中要求确诊的病例，需要满足同一份检测样本中SARS-CoV-2的ORFlab及N基因的2个靶标RT-PCR检测均为阳性，或2种不同类型标本的RT-PCR同时出现单靶标阳性，或同种类型标本2次采样的RT-PCR均出现单靶标阳性[15-16]。如果检测结果阴性，亦不能排除感染的可能。一般认为SARSCoV-2在细胞中其mRNA往往数倍于病毒的基因组RNA，且可转录出不同长度的mRNA，这些 mRNA都携带N基因，仅少数mRNA携带ORF1ab。现在应用的试剂盒所检测的多为细胞内的病毒mRNA，因患者标本中N基因mRNA的拷贝数远高于ORF1ab基因，故当SARS-CoV-2拷贝数较低时，携带N基因的检测单通道阳性检出率较高。此外，N基因在SARS-CoV-2核酸序列中较ORF1ab保守，故还可能有少数样本由于其他冠状病毒种的核酸序列与其发生交叉反应，导致N基因扩增阳性而ORF1ab出现阴性的实验结果。临床上对于核酸检测为阴性或单通道阳性的病例需谨慎分析与解读，应充分考虑到各环节中可能造成结果不准确的影响因素[9-10,16]，例如保证试剂盒质量、规范采样、样本的保存和运输、及时送检，优化检测流程，提高实验室人员检测技术水平等，是保障和提高核酸检测准确性的有效措施，亦是影响目前抗疫的关键环节。

此外，有的COVID-19患者康复期病毒核酸检测结果由“阴性”转呈“阳性”反应，备受关注。分析其原因[17]与以上所述的RT-PCR技术因素等导致的“假阴性”密切相关之外，可能还与患者呼吸道纤毛上皮损伤致排出功能降低及分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）结合病毒的解离多种原因相关。裴银辉等[17]认为由于核酸检测靶点为病毒的核酸片段，并不能反映样本中是否含有感染性的完整病毒颗粒。SARS-CoV-2感染检测显示真阳性的病例体内存在病毒复制，具有极高的传染风险。

COVID-19患者治愈后是否会复阳？李泉等[18]对COVID-19恢复期病毒核酸检测复阳与阴性患者淋巴细胞亚群及形态学特征的比较研究发现，所有COVID-19 阴性反应患者外周血中均出现较多变异的淋巴细胞，平均值为12.13%，最低为 6%，最高为28%。显示这些患者已经建立免疫功能、产生了细胞免疫。但恢复期病毒核酸检测复检阳性病例的变异淋巴细胞平均仅为 2.36%。因此，变异淋巴细胞似可提示COVID-19患者是否产生细胞免疫或是免疫功能建立的一个重要观察指标。

3 结语

目前，最常用的病原学实验诊断仍然是采用RTPCR进行核酸检测，核酸检测结果是COVID-19患者确诊和治愈出院的重要依据，但临床检验中暴露的SARS-CoV-2核酸检测“假阴性”问题，对于核酸检测质量提出了更高的要求。SARS-CoV-2核酸检测的“假阴性”问题可从上述多个关键影响因素着手予以应对，以尽可能降低核酸检测的“假阴性”反应，为临床提供准确、可靠的检测结果。

临床免疫学研究提示，IgM在病毒感染早期1周左右出现，是急性期病毒感染的诊断指标，但抗体滴度相对较低、维持时间较短。IgG在病毒感染后3周左右出现，并在感染者体内存在较长的时间，抗体滴度有一个持续增高的过程。因此，可通过核酸检测与特异性抗体动态检测的结果，明确是否为SARS-CoV-2感染。

国家卫生健康委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》（第七版）实验室检查中新增了血清SARSCoV-2抗体检测的内容，当核酸检测为阴性时，可通过观察IgM、IgG的动态变化，以明确COVID-19诊断[19]。无论后续核酸检测是否为阳性，若一周左右再次检测抗体，IgG由阴性转呈阳性反应，或抗体滴度持续升高达4倍及以上，则可判断急性或近期感染，可作为SARS-CoV-2感染的血清学证据。IgM、IgG联合SARS-CoV-2核酸检测，可能是目前实验诊断COVID-19的优选检测方案。当然，针对SARS-CoV-2感染不同的检测方法，均存在其相应的方法学局限性，因此，对于不同实验方法的检测结果应该密切结合临床，严谨地进行分析，以为疫情防控提供科学、可靠的实验诊断结果。