ETV转录因子及其在心律失常中的作用*

方丽花 李泱 张建成

ETV 转录因子是ETS(Ets translocation variant)基因家族的一个亚家族,对参与细胞增殖、分化、凋亡、组织重塑与再生等起着关键调节作用[1]。Rommel等[2]研究显示ETV 基因是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导心房重构所必须的,可能也参与了心房颤动的发生。Shekhar 等[3]证明ETV1在心脏快速传导组织中高表达,ETV1条件敲除小鼠可能存在His束-浦肯野纤维系统(HPS)结构缺陷。Lee等[4]认为经过非转基因干预,ETV2/ER71可直接将出生后的人类细胞重新编程为具有功能的成熟内皮细胞。ETV2/ER71则为内皮细胞的发育所必须[5]。笔者对ETV 转系因子及其在心律失常中的作用作一综述。

1 ETV基因家族

ETV 是ETS转录因子的一个亚家族。1983 年,首个ETS转录因子基因在禽类E26红母细胞增殖症病毒中被鉴定出来,故命名为E-26转化特异性基因[6]。ETS家族由28个基因组成,含进化保守的85个氨基酸。ETS结构域显示有三个α-螺旋和一个β-折叠,共同形成翼状螺旋-转角-螺旋基序,而5′-GGA(A/T)-3′则为核心结合序列[7]。利用基因敲除策略发现,ETS家族分为12个亚家族:Ets、TCF、Erg、PEA3(ETV)、GABP、Elf、Erf、Yan、Spi、ESE、PDEF和ER71(ETV2)[8],在哺乳动物中发现了20多个不同的ETS基因,它们的基因产物在ETS域外具有广泛的同源性,而ER71/ETV2与其DNA 结合域以外的其他已知蛋白没有同源性。PEA3亚家族具有N-未端的反式激活结构域,由ETV1(ER81)、ETV4(PEA3)和ETV5(ERM)组成。DNA 序列特异性系统分析表明,ETV 家族成员优先与5′-ACCGGAAGT-3′结合。作为激活域,ETV 结构域是以分子内方式调节的,即ETV 结构域两侧的氨基酸抑制其DNA 结合能力,而特异抗体可解除此分子内抑制[9]。

ETV 也可以对蛋白质-DNA 和蛋白质间相互作用产生影响,从而调节后者活性。而ETV 结构域外部的序列差异是各自特性的结构基础,加之表达模式差异,最终导致ETV发挥不同的生物学效应。

2 ETV的生物调控机制

2.1 成纤维细胞生长因子-RAS-细胞外信号调节激酶(FGF-RAS-ERK)调节通路 ETV 的重要性首先在癌症的研究中得到证实,ETV 基因的异常激活可以模仿致癌的RAS细胞转化,并发现三个PEA3/ETV 基因和一个ERG基因与肿瘤发生有关,ETV1、ETV4、ETV5 转录因子位于FGF-RAS-ERK 信号通路的下游[10]。Rommel等[2]认为ETV1通过G 蛋白偶联受体启动,被RAS-MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)通路激活;ETV1 亦可作为Ang II诱导的MAPKs活化下游的转录靶点,参与心房重构。研究表明,ETV 转录因子在胚胎发育过程中受FGF 信号调控,CHIPseq分析揭示受体酪氨酸激酶抑制剂SPRY2是PEA3/ETV家族基因的直接靶标,Garg等[10]通过ETV-TKO 突变体晶状体的RNA 原位杂交证实了这一点。进一步研究显示,Sprauty(SPRY)蛋白反过来可以抑制Ras-MAPK 信号转导,这表明SPRY 的ETV 调节构成一个负反馈回路。

2.2 NeuRegin-1神经调节蛋白1(NRG1)调节通路 NRG1通过核糖体S6 激酶/丝裂原和应激激活蛋白激酶(RSK/MSK)依赖的信号通路,上调胚胎心脏传导系统-β-半乳糖苷酶(cardiac conduction system-lacZ)报告基因的表达。NRG1处理可以增加CCS-LacZ在胚胎心脏中的表达,而ETV1在胚胎和出生后心脏中的表达也显示NRG1 应答[11]。Shekhar等[11]发现,心脏ETV1受NRG1信号的翻译后调控,且ETV1是心内膜来源的NRG1调节心脏快速传导系统基因转录过程中的关键因子。NRG1与其同源受体ErbB4的结合导致二聚化,从而激活下游诸多信号通路(Src、PI3K 和Ras-MAPK)而发挥作用[11]。Fatkin等[12]构建了一个机制模型,指出心脏转录因子不是孤立作用的,而是与共激活因子和染色质调节因子相互作用,构成大分子转录复合体而发挥效应。转录中介因子(mediator,MED)复合体在真核生物基因转录中起着关键的作用。首先发现MED 介入这些病理是MED13L 基因错义突变与大动脉转位的相关性。如今,MED13和MED15也被认为与人类先天性心脏病有关。有证据表明,心脏MED13 主要参与核受体信号传导的调节,从而驱动参与调节心脏和全身能量稳态的基因的转录。MED13还与多种病理状况相关,例如代谢综合征和甲状腺疾病相关的心力衰竭[13]。

2.3 Jag1-Notch调节通路 Garg等[10]通过转录组分析表明ETV 全敲除(ETV-TKO)突变体的晶状体中编码Notch信号的配体基因Jag1下调,ETV-TKO 晶状体中Jag1蛋白表达显著降低,Notch受体通过Jag1 激活的蛋白水解产物Notch1-ICD(Notch1 intracellular domains)染色严重减少;该研究支持ETV 通过调节Jag1-Notch信号,控制晶状体细胞分化。Li等[14]和Garg等[10]研究证明了晶状体中Jag1表达受ERK 介导的FGF信号调控。研究表明ETV 的缺失引起ERK 信号转导的严重紊乱;缺乏ETV 的晶状体中ERK 信号转导升高,异常的ERK 激活可能刺激正常情况的下游靶标,这些靶标通常因FGF信号丢失而沉默,导致进一步补偿性变化,从而重新连接信号网络,它强调ETV 在由FGF 激活的稳定细胞内信号转导中的复杂作用,由此给出FGF 连接到Notch信号转导的完整分子级联模式。

3 对心血管系统的生理效应

3.1 形态发生中的功能 PEA3亚家族在形态发生中发挥重要作用,如早期发育、器官发生等[15]。ETV1主要在人脑、心脏中高表达,而在骨骼肌、肾脏等表达较低。ETV1在各发育阶段的梳状心房心肌(pectinated atrial myocardium,PAM)中均有表达[3]。在胚胎期,ETV1定位于PAM 和心室小梁心肌。在产后,ETV1表达仍保留在PAM 中,但主要局限于心室中的心室传导系统和HPS。ETV1在窦房结和房室结中的表达较低。免疫荧光显示,ETV1在成年小鼠心脏的PAM 和心室传导系统中高表达。ETV1在成熟猪和胚胎人心脏中的表达模式是保守的[11]。值得注意的是,心脏转录因子具有多重相互作用,在心房肌细胞中已鉴定的ETV1结合位点,有三分之二与其他心脏转录因子的结合位点重合,且近一半是TBX5结合位点。尽管Rommel等[2]的数据表明,其中一些基因可能另外是ETV1的伴侣,但对何时、何地以及如何地将ETV1募集到转录复合物中的全面了解尚待研究。

ETV2的种间保守性很低,与其他ETS 蛋白在保守的DNA 结合结构域只有67%同源性,人和蛙及蛙和鱼之间分别63%和81%的同源。ETV2/Etsrp71/ER71 对内皮细胞系的发育非常重要[1]。ETV2在睾丸中也有表达,在肾上腺及发育中的大脑低表达。在ES/EB 分化系统中,ETV2 突变的细胞停滞在胚层祖细胞阶段,未进展至侧板中胚层。ETV2过表达导致Pdgfra下调,促使向内皮细胞分化。伴随ETV2突变体中内皮和造血谱系缺失或ETV2突变,心肌细胞和平滑肌细胞增殖[1]。

ETV4和ETV5在胚胎干细胞(ESC)中表达,二者可能参与ESC的自我更新和多潜能分化[16]。有研究提示,双基因敲除ETV4和ETV5,ESC 的增殖和分化降低,参与血管形成和再生[14]。

3.2 血管内皮生成中的功能 心内膜细胞在发育中发挥着独特的作用,它们诱导一些心肌细胞形成心室内的心肌嵴。这些细胞经心内膜向间充质细胞转化(Endo MT),填充心内膜垫,形成心脏瓣膜和部分室间隔和房间隔[17]。重要的是,心内膜及其衍生物组织畸形,如先天性心脏瓣膜病或心肌致密化不全,与ETS等转录因子密切相关[15]。ETS在内皮细胞发育和功能中的作用被广泛认可。Schachterle等[18]报道,在目前存在的多种ETS 转录因子中,ETS1、FLI1、ETV1、ETV5、ERG 和ETV6在早期胚胎心脏中含量高。人内皮细胞表达19 个ETS 因子,其中ETS1、ETS2、FLI1、ETV2和ETV6为小鼠血管发育所必须,ETS因子通过结合多种内皮细胞基因来调节血管发育。Lee等[4]研究首次证明,经过一段时间非转基因干预,ER71/ETV2 可直接将人成纤维细胞重新编程为具有生理功能的成熟内皮细胞。这种新的重新编程模式将使各种心血管疾病的自体细胞和个性化药物基因组治疗成为可能[4]。

3.3 心脏快速传导系统中的功能 心脏快速传导组织分别源于梳状和小梁状心肌。此阶段,梳状和小梁细胞沿着心腔内膜表面呈片状生长,并获得快传导基因程序,在快速传导组织维持到成年期[11]。ETV1 在快速传导组织中高表达,通过富集Nkx2-5、Gja5 和SCN5A 建立快速传导表型。ETV1基因缺陷鼠表现出心脏传导缺陷和心室传导系统异常[15]。一项表型全基因关联研究(PheWAS)[19]显示,ETV1与束支传导阻滞和心脏传导阻滞有关。

HPS起源于心脏发育期间的小梁细胞系。小梁的形成受心内膜衍生的NRG1调节,后者通过其同源受体复合物ErbB4和ErbB216 完成该效应[2]。NRG1、ErbB4 或ErbB2基因缺失可导致小鼠心脏缺乏快速传导的小梁区。进一步发现NRG1依赖的信号通路参与到心肌细胞的基因调控网络,负责HPS 形成。Shekhar等[3]证明ETV1 依赖基因网络与心房和浦肯野纤维独特的电生理特性有关,心肌细胞特异性ETV1缺失导致心脏传导异常、传导相关基因(Nkx2-5、Gja5和SCN5A)表达下调。Kim 等[20]过表达IRX3显示,IRX3可促进12个HPS富集的基因表达,IRX3与NKX2-5/TBX5转录因子复合体相互作用,维持正常的HPS功能。

4 对心律失常的作用

4.1 与心脏分化异常 众所周知,Wnt信号途径对促进心肌细胞分化起着关键作用,ETV2在正常胚胎中可抑制Wnt通路,ETV2突变体,心肌细胞增殖与分化[5]。ETV2 过表达则影响ES/EB中胚层分化系统功能[21]。

4.2 与房性心律失常 Rommel等[2]发现,小鼠心肌细胞过表达ETV1心房结构重构,诱导房性心律失常的发生;反之,心肌细胞特异性敲低ETV1则可预防AngⅡ介导的心房重构。ETV1敲除显示,浦肯野氏纤维、心房肌和心室肌细胞的钠电流呈现出不均匀性和正常功能丧失。有趣的是,这些小鼠的表型异常在出生后初期并不显现,但在青春期变得凸显。12周时,过表达ETV1的小鼠具有明显的心房扩张和血栓形成,其心室大小和功能正常。扩张的心房的组织病理学检查显示大量间质纤维化,伴有肌节紊乱和线粒体耗竭,伴有心电图上P波消失,提示传导改变。

研究表明,ETV1 基因多态性与心房传导缺陷密切相关[15]。永久性心房颤动患者心房组织样本中发现ETV1显著上调[3]。Rommel等[2]敲除ETV1,可防止Ang II引起的心房纤维化。目前尚不清楚是否有最终的共同信号分子参与心房颤动的启动与维持。

4.3 与室性心律失常 心室颤动与IRX3有关[22],IRX3在浦肯野纤维的传导调节中起着重要作用。梳状心房心肌和HPS特殊的传导特性与关键传导基因有关,其中包括SCN5A(编码心肌钠通道Nav1.5的α亚单位)和Gja5(编码高电导缝隙连接蛋白40)最为重要[11]。Shekhar等[11]对ETV1基因敲除小鼠进行电生理分析,发现ETV1缺陷心脏传导异常,表现为P 波、PR 间期和QRS 波持续时间延长。此外,30%的ETV1敲除鼠表现为束支阻滞。心内膜电图记录显示,ETV1敲除鼠的AH 和HV间期延长。ETV1基因缺陷的小鼠的心室传导系统中Nkx2-5、Gja5和SCN5A 的水平降低。生理状态下,在心房、浦肯野和心室肌细胞中钠电流的生物特性并不均匀,起着心房和浦肯野细胞有更大的钠电流,相应Nav1.5的表达水平也更高。ETV1的缺失导致心房、浦肯野和心室肌细胞间钠电流完全同质化,表现出明显的传导缺陷。

5 总结和展望

随着ETV 的发现,已经破译了ETV 介导的中胚层形成,内皮和心脏分化机制的诸多关键环节。对ETV 上、下游基因调控级联的深入探究,是我们清晰地认识到心脏转录因子并非孤立作用,而是与共激活因子和染色质调节因子提供形成大分子转录复合体发挥效应。因此,了解心脏转录因子对心脏特别是传导结构与功能的调控作用,对于揭示心律失常的发生发展机制和干预靶点的寻找有着重要的意义。