circRNA在肝细胞癌致病机制中的研究进展

张亚，浦涧

(1. 右江民族医学院研究生学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院，广西 百色 533000)

在全世界恶性肿瘤中病死率居于第二位的恶性肿瘤——肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是肝脏原发性肿瘤中最常见的类型，尤其在我国最为多见[1]。我国每年有超过300 000人死于肝癌，这对我国国民的身体健康造成了极其严重的危害，而且其发病率仍然呈上升趋势，这主要是近几十年来病毒性肝炎、酗酒和肥胖的发病率增加所致[1-2]。其中导致我国HCC发生的主要因素为乙型病毒性肝炎后的肝硬化，而西方国家比较常见的因素则是长期大量的饮酒，此外还有含黄曲霉毒素食物的摄入、非酒精性脂肪肝损伤等[3]。虽然近年来已经在HCC的诊疗技术上取得较大进步，但是传统的手术切除仍然是目前延长肝癌患者生存期最有效的治疗方法，也是唯一能治愈HCC的方法[4]。但有研究显示，HCC手术切除术后5年复发转移率可高达60%～70%[5]，大约有50%的患者在手术切除后5年内死亡[6]。大多数HCC患者处于疾病的早期时不易被发现，究其原因主要为HCC缺乏特异性的标志物，等到发现的时候已经失去了手术医治的最佳时期，因此HCC患者的治疗效果和预后较差[7]。除此之外，HCC的复发和转移也是影响HCC患者是否能够得到长期生存的关键要素。

近年来，对原发性肝癌致病机制的研究，重点涉及了致癌基因、抑癌基因、表观遗传学、非编码RNA等方面，特别是针对环状RNA(circRNA)在原发性肝癌的致病机制研究中，涉及了HCC的干性转变、上皮间充质转化(EMT)、细胞miRNA的表达异常等，并获得了较大的进展。本文就circRNA在HCC发生发展中的作用机制研究部分新进展作一综述。

1 circRNA概述

circRNA是人类最早于20世纪70年代在病毒中发现的一类RNA[8]，它独特的天然封闭式环状结构使自身不容易受RNA外切酶的影响而发生降解，因此自身的表达更加稳定[9]。但当时人们的知识水平与技术条件有限，发现circRNA是一种不编码蛋白质的RNA，因此认为它没有生物学功能，只是一种由于剪接错误而产生的一类特殊的内源性非编码RNA分子，从而忽略了对它的研究。近些年来随着高分子通量测序等生物技术的飞速发展，越来越多的circRNA被证实在很多肿瘤的发生、发展中扮演着至关重要的角色[10]。研究发现，circRNA是共价封闭的环状RNA分子，通常来自于外显子序列，并在正侧剪接位点被剪接而成；circRNA大多数是来自于基因编码区的外显子，其它circRNA来自于5′-或3′-非翻译区(5′- utrs或3′- utrs)、内含子和基因间区，以及反义RNA[11]。因此，circRNA被分为4类：外显子circRNA、内含子circRNA、外显子-内含子circRNA和基因间circRNA。circRNA丰度，甚至是通过选择性剪接表达的circRNA亚型丰度，都因细胞类型不同而不同；circRNA在大脑中富集，并在胎儿发育期间大量增加[12]。这些特征的发现，使得研究人员提出了关于circRNA的生物合成、在顺式和反式中的调控、功能及其作用机制的基本问题，并成为当今的研究热点[13]。此外，circRNA在细胞中的运输和降解也是一个具有挑战性的未解问题。近几年来，越来越多的circRNA被发现在肿瘤细胞中存在着异常表达，它们的异常表达影响了癌细胞的侵袭和迁移能力，也是癌症患者转移复发和死亡的重要原因。但这些发现只是冰山一角，对于人类来说，成千上万存在于自然界的circRNA如今仍然是谜一样的存在。

2 circRNA的作用机制

circRNA近几年来作为被广泛研究的对象，它参与了多种恶性肿瘤的细胞增殖、分化、迁移、侵袭和许多信号通路，尤其是与HCC之间的关联已成为当前研究的热门话题。下面从circRNA在HCC中影响miRNA的表达、调节干性转变及上皮间充质转化(EMT)，以及细胞自噬等综述其致病机制。

2.1 circRNA与miRNA miRNA是一种内源性非编码单链内源性染色体编码的核苷酸小分子RNA，长度为19～25个核苷酸的小分子RNA，它们通过调控mRNA翻译和降解而调节抑癌基因和癌基因的表达，控制肿瘤细胞的发生与发展，在几乎所有与肿瘤相关的过程都发挥着重要作用，对多种肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭以及转移有重要意义[14]。比如，有学者通过实验研究发现miRNA-338-3p在癌组织或细胞中的表达较低，而在癌旁组织中的表达明显要高于癌组织，并且通过实验证明了miRNA-338-3p与肿瘤细胞的迁移和增殖有关[15-16]。Salmena L等[17]在2011年首次发现并证明circRNA主要是作为竞争性内源RNA(ceRNA)，即作为miRNA分子“海绵”来发挥作用，又被称为竞争内源性RNA机制。ceRNA上存在着多个能够与miRNA互补结合位点，自身来充当miRNA的海绵，与miRNA竞争性结合，从而发挥对下游靶基因的调控作用，参与HCC的发生与发展[18]。

在肝癌的发生发展中，miRNA在circRNA调节肝癌发生发展的致病机制中充当的重要角色已部分获得阐明，如Yu J等[19]通过实验证实circRNA-104718通过靶向miR-218-5p/TXNDC5信号通路促进肝癌的进展。circRNA-104718作为ceRNA，通过与硫氧还蛋白结构域蛋白5(TXNDC5)mRNA竞争，并直接与miR-218-5p结合，解除miR-218-5p靶TXNDC5的抑制，从而导致miRNA功能的抑制，促进了细胞的增殖、迁移、侵袭，以及抑制了细胞的凋亡，并且在肝癌组织中过表达的circRNA-104718可以增加肿瘤的体积和转移率。而且，circRNA通过海绵样作用于miRNA，形成circRNA-miRNA-mRNA调控网络来影响肝癌的发生发展[20]。如Liu Z等[21]发现circRNA-5692能通过circRNA-5692/miR-328-5p/DAB2IP通路抑制miR-328-5p，促进DAB2IP表达，从而抑制肝癌的进展。Jiang P等[22]发现circ_0091579可通过介导miR-940调节TACR1的表达来介导HCC的发展，他们通过注射Huh7细胞建立小鼠异种移植模型，证实敲除circ_0091579可以下调circ_0091579基因表达来抑制HCC细胞的生长，这可能与其通过ceRNA的机制介导miR-940/TACR1轴降低肿瘤细胞的生长相关。在乳腺癌中也存在与HCC类似的机制，Xie J等[23]用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)或蛋白印迹法(Western Blot)检测circ_0061825在乳腺癌(BC)组织和细胞中呈过表达，通过双荧光素酶报告基因分析确定circ_0061825、miR-593-3p和FGFR3之间的靶向关系以及动物实验得出，circ_0061825作为miR-593-3p的分子海绵，可以通过海绵包裹miR-593-3p来调控FGFR3的表达来调节BC恶性进展，除此之外还发现通过敲低circ_0061825能证实miR-593-3p过表达可通过下调FGFR3抑制BC细胞的恶性进展。类似的原理在胃癌中也被证明，Yang X等[24]发现circ_0110805是一种在耐顺铂的胃癌组织和细胞中表达上调高表达的circRNA，其沉默可以抑制胃癌的发展，通过海绵miR-299-3p下调ENDOPDI表达来抑制胃癌细胞对顺铂等化疗药物的耐药性。

2.2 circRNA与HCC的干性转变 肿瘤干细胞(cancer stem cells/tumor initial cells，CSCs)被认为是恶性肿瘤不易被治疗的重要因素之一，它一方面能够通过自我复制保持其自身的“干性”，另一方面也可以通过分化成为肿瘤细胞，从而促进肿瘤的生长。目前可检测的肿瘤细胞干性标志物主要有CD133、CD44、CD90、ALDH1、ABCG2、核黄素等，并且已经有越来越多的证据证实circRNA在与CSCs相关的调控信号通路中扮演着至关重要的角色，在这些信号通路中，它们既可以作为癌基因，也可以作为肿瘤抑制因子，而Wnt/β-catenin信号通路则是参与CSCs调控的关键通路[25]。研究发现，circ-ABCC1上调通过CD133-/Caco2或CD133-/HCT15介导促进结肠直肠癌细胞的干性、集落形成和转移，并证实circ-ABCC1是通过激活Wnt/catenin通路促进结肠直肠癌进展[26]；Sun J等[27]发现hsa_circ_0001806在结肠直肠癌组织中显著上调，通过激活hsa_circ_0001806/miR-193a-5p/COL1A1轴促进结肠直肠癌细胞的干性，并与结肠直肠癌的TNM分期、浸润深度、淋巴结转移和远处转移相关。Zhu YJ等[28]在研究中首次证明circZKSCAN1通过与FMRP竞争性结合来阻断CCAR1与FMRP结合，使Wnt/β-catenin信号通路失活，从而抑制肝癌的细胞干性，诱导肿瘤静止，并通过抑制癌细胞的干性来抑制多种恶性行为。此外，还有研究发现，circ-MALAT1通过充当ceRNA，并与miR-6887-3p竞争性结合，上调癌基因(JAK2)和增加磷酸化JAK2，增强JAK2/STAT3信号转导，从而促进肝CSCs的自我更新，促进肿瘤的发生发展[29]。

2.3 circRNA与HCC的上皮间充质转化 上皮间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)是标志恶性肿瘤细胞开始发生转移以及获得迁移和侵袭能力的重要过程，肿瘤细胞上皮间充质转化的发生一般预示着肿瘤恶性进程的开端[30]。在此过程中伴有E-cadherin表达的减少、N-cadherin和Vimentin等分子标志物的升高[31]。肿瘤细胞通过EMT使其失去与基底膜、细胞之间的黏附连接，获得了较高的游走迁移、抗凋亡和降解细胞外基质的能力，从而获得间质细胞的形态和特性，使得肿瘤细胞更易离开原位，发生原位浸润或者远处转移[32]。例如，在HCC中，有研究者发现circ-000663在HCC组织中呈低表达，而高水平的circ-000663可以抑制HCC细胞的增殖来发挥抑癌作用，与HCC的EMT增殖、侵袭及转移有着重要的关系，这将在很大程度上改善HCC患者的预后，最大程度地降低HCC的复发与转移[33]； Zhang X等[34]发现circSMAD2在肝癌组织中表达下调，且与肿瘤分化程度相关，circSMAD2过表达通过抑制miR-629的表达来抑制肝癌细胞的迁移、侵袭和EMT，从而促进肝癌细胞的EMT进程。而同样地在胃癌中，也有学者发现circFNDC3B表达增加、circ-HIAT1的表达降低，促进了胃癌的EMT并诱导远处转移，这也是进展期胃癌患者预后不良的最主要原因[35-36]。Pu J等[37]在前期的研究中发现HCC的发展与hsa_circ_0000092/miR-338-3p/HN1的调控轴有关，主要机制是通过hsa_circ_0000092与miR-338-3p竞争性结合，从而降低miR-338-3p的表达，上调下游HN1的表达水平，加速了HCC的EMT进程，使得HCC组织中的肿瘤细胞发生增殖、迁移、侵袭以及生成血管，促进了HCC的进展。

2.4 circRNA与细胞自噬 自噬一般被认为是降解受损或不需要的蛋白质和器官的一种非选择性途径。细胞自噬功能在肿瘤发生发展的不同阶段中，起着不同的作用——抑癌或致癌作用，而circRNA与细胞自噬关系密切。在乳腺癌中，Liang GH等[38]发现与自噬相关的circCDYL在BC组织中的表达水平比在癌旁组织中的表达水平明显升高，circCDYL通过miR-1275-ATG7/ULK1轴提高BC细胞自噬水平，在体内外均增强了BC细胞的恶性进展；在临床上，BC患者肿瘤组织和血清中circCDYL的增加与肿瘤负荷高、生存期短和临床治疗反应差有关。在肺癌中，circHIPK3被认为是肺癌亚组中关键的自噬调节因子，Chen XY等[39]认为circHIPK3通过MIR124-3p-STAT3轴调节自噬诱导的细胞系(A549和H838)的自噬，从而促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭，研究还揭示了高circHIPK3和linHIPK3比率(C/L比值)(>0.49)是患者预后不良的指标，尤其是在非小细胞肺晚期的癌患者中，适当上调circHIPK3/linHIPK3之间的比例可能对非小细胞肺癌(NSCLC)患者具有治疗潜力。在口腔鳞癌中，circCDR1as通过AKT/ERK1/mTOR信号通路上调处于缺氧条件下的口腔鳞癌细胞自噬以促进肿瘤细胞存活，并且circCDR1as的高表达通过促进自噬提高了口腔鳞癌细胞在低氧微环境下的细胞活力，以此来适当地加强内质网应激来抑制癌细胞的凋亡，从而促进恶性肿瘤的进展[40]。在肝癌中，许多研究证明了circ-SPECC1在多种癌细胞中的表达水平明显升高[41]，Zhang B等[42]也证实了circ-SPECC1能够促进体内肿瘤的生长，circ-SPECC1作为CeRNA，通过竞争性拮抗miR-33a的抑癌作用促进氧化应激下肝癌细胞的增殖，并且抑制了细胞的凋亡，从而对肝癌的恶性进展起到促进作用；此外，在实验中加入自噬抑制剂3-MA后证明了细胞自噬抑制在氧化应激下HCC的进展。Lin SB等[43]的研究中发现circ_0027345可以通过与miR-345-5p结合来调控肝癌细胞的存活、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭和自噬；circ_0027345过表达可通过下调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的水平来抑制细胞凋亡和自噬，加速细胞周期进程，促进肿瘤细胞的生长、迁移和侵袭。

3 小结

circRNA是近年来国内外医学界的研究热点，目前研究主要集中在HCC发展过程中的机制，涉及了HCC的干性转变、EMT、细胞miRNA表达异常以及细胞自噬等，并获得较大的进展，并且已发现诸多circRNA-miRNA- mRNA调控网络与肿瘤的发生与发展相关。circRNA是一类比较稳定的天然呈封闭环状的非编码RNA，它在多种恶性肿瘤细胞中都有异常表达——升高或降低，目前已发现在HCC组织中表达量升高的circRNA有hsa_circ_0056836[44]、hsa_circ_0003645[45]、hsa_circ_0016788等[46]，而hsa_circ_0001649[47]、circADAMTS13[48]等表达水平降低，它们很多是通过充当ceRNA与miRNA竞争性结合，靶向调控相应通路来促进HCC的进展。随着对circRNA在肿瘤致病机制方面研究的不断加深，研究者们逐渐发现有的circRNA是通过促进或者抑制恶性肿瘤细胞的干性转变来调控肿瘤的进展，也有的circRNA是促进肿瘤细胞的上皮间充质转化(EMT)进程来加快肿瘤的恶性进展过程，还有的circRNA则是通过提高肿瘤细胞的自噬水平来抑制或加速肿瘤的进展方向。

综上所述，在HCC中，大多数circRNA主要是作为竞争性内源RNA(ceRNA)，通过充当miRNA海绵来解除对下游相对应靶基因的抑制作用而发挥对肿瘤的调控作用。circRNA可与蛋白质相互作用，调节基因的剪接或转录；也可翻译成蛋白质或小肽；还参与表观遗传调控。也有一定数量的circRNA可以通过调节细胞干性、EMT以及自噬水平，进而调节HCC的生长、侵袭和迁移，从而影响患者的预后。由于circRNA能够在各种组织中得到稳定的表达，这大大增加了其作为生物标志物和治疗靶标的潜力，因此，可以作为HCC患者早期诊断和有效治疗的生物标记物。尽管对circRNA在肝癌中的功能研究已经取得了很大进展，但大多数circRNA在肝癌进展中的功能和机制仍远未完全阐明，并且要将其应用于临床还需要很长的时间，期待我们更多的努力探索。