鼻咽癌EB病毒DNA检测数据分析

张彦萍 高力英 韩鹏炳 杨银芳

甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州730050

鼻咽癌是头颈部常见恶性肿瘤之一，其发生率在我国南方地区较高，由南到北逐渐降低［1］。我省为鼻咽癌非高发区域。EB病毒是鼻咽癌发病的重要原因之一。血浆EBV-DNA是鼻咽癌强有力的生物标志物［2］，检测不同时期鼻咽癌患者血浆中EBV-DNA含量在鼻咽癌早期筛、早期诊断、临床分期、疗效评估、预后判断等方面有着重要的临床意义［3］。因检测方法、试剂不同，EBV-DNA含量数据亦不相同［4］。EBV-DNA检测结果是否受不同性别、年龄的影响，暂无明确定论。不同肿瘤分期及免疫功能同样影响鼻咽癌患者血清EBV-DNA检测含量。现将我科88例鼻咽癌EBVDNA检测过程及阳性率与其性别，年龄，分期，免疫功能的变化简单介绍如下，以期为相关研究提供临床数据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018年3月至2019年3月就诊于我科的鼻咽癌患者88例，患者来自我省各个市县地区。其中男性65例，女性23例。年龄15～71岁，中位年龄51岁。依据AJCC第8版进行分期［5］，其中Ⅰ期2例，Ⅱ期0例，Ⅲ期36例，Ⅳ期50例。对所有患者进行EB病毒NDA检测、免疫功能检测。EBV DNA数值＜4.0E+2为阴性，≥4.0E+2为阳性。

1.2 方法 采用圣湘生物开发的EB病毒核酸定量检测试剂盒进行检测，具体如下：（1）取出红细胞裂解液，室温放置，混匀后备用。（2）出全血样本，充分混匀（如果混匀后管盖上有残留全血样本，瞬时低速离心即可），取样时用加样枪吹打2～3次（样本静止时全血中的白细胞自然沉降，造成分布不均一，充分混匀），取1mL红细胞裂解液加入2mL离心管，加入200μL全血样本，混匀（颠倒混匀20～30次），12000rpm/min离心1min，去上清。（3）向沉淀中再加入1mL红细胞裂解液，充分混匀（颠倒混匀20～30次，确保无明显红色状沉淀），12000rpm/min离心3min，去上清。（4）再加入1mL生理盐水，无须混匀，直接12000rpm/min离心10min，吸净上清液（全血样本中，去上清时，不要把沉淀一起吸弃，否则会出现Ct值拖/或者假阴性）。管底白色沉淀即为分离得到的白细胞，可用于核酸提取。于沉淀中加入100μL核酸释放剂，震荡混匀，75C恒温处理20min，离心1～2min备用。（5）加样：每个PCR反应管中加入上述处理后的待测样本，阴性对照，阳性对照以及定量参考品；每管加入PCR-混合液40μl，盖上管盖（去除气泡后），2000rpm离心30s，PCR扩增（在扩增与分析区进行），将PCR反应管放入扩增仪样品槽，按对应顺序设置阴性对照阳性对照，定量参考品A～D以及未知样本。

双击图标SLAN8.2.2实验向导孔板编辑选择反应孔-选择项目（EB）选择样本类型，分别选择待测样品阳性对照阴性对照和标准品。选好标准品后再选择自动标准品，弹出自动标准品对话框，复管个数：1；起始浓度：4×107；稀释梯度：递减。点击确定即可。单击实验运行-开始。≥4.0E+2（4×102）表示阳性，反之为阴性。

2 结果

88例受检患者中59例EBV DNA检测结果呈阳性，阳性率为67.0%（59/88）；阳性患者中男性有44例，阳性率为74.6%（44/59）；女性15例，阳性率为25.4%（15/59）。依据《中国年龄划分标准》［6］划分为4个年龄段，中少年（7～17岁）共2例，1例阳性；青年（18～40岁）共14例，11例阳性；中年（41～65岁）共60例，37例阳性；老年（66岁以上）共12例，10例阳性。依据AJCC第8版［5］分期进行临床分期：Ⅰ期占1.7%（1/59例），Ⅱ期0例，Ⅲ期占33.9%（20/59例），Ⅳ期占64.4%（38/59例）。依据淋巴细胞免疫分析结果59例EBVDNA阳性患者中33例（55.9%）患者出现免疫功能不同程度低下。

3 讨论

我国鼻咽癌男女发病比率为2.8∶1，其中以30～60岁多见，40～59岁发病高峰［7］。2018年至2019年我院鼻咽癌患病率男性高于女性，患病率比约3∶1。本研究EBV DNA检测阳性率为67.0%，其中男性占74.6%，女性占25.4%，好发年龄41～65岁。2013年我国男性鼻咽癌新发病例约30 000；女性鼻咽癌新发病例约12 000，年龄在25～29岁开始迅速上升，男性在60～64岁达到高峰，女性在75～79岁达到高峰，之后明显下降［8］。张庆等［9］通过检测9445例EB病毒感染者发现，EB病毒感染存在性别、年龄及不同季节的差异性，季节性差异可能因地域不同而引起。凡任芝［10］研究发现，EBV DNA阳性率与患者的性别及年龄段均无相关性；TNM分期中Ⅲ期和Ⅳ期的EBV DNA浓度检测结果的差异有统计学意义，且Ⅳ期较高；随T分期的发展，各期EBV DNA阳性检出率增高，M和N分期患者的差异无统计学意义。可见对于不同性别、年龄是否影响EB病毒检测结果尚存在分歧。本研究检测结果提示，Ⅳ期阳性率最高，Ⅲ期次之，Ⅰ期较少，阳性率随分期的降低而下降，证明分期越晚，EBV DNA检测浓度越高。常莉等［11］研究发现，儿童感染EB病毒后，不同性别、年龄段EBV-DNA检测结果无统计学差异。成年人与儿童感染EB病毒存在性别差异。对于儿童鼻咽癌EBV-DNA研究暂无明确大数据说明。由上可见EB病毒感染与性别、年龄、分期、免疫功能皆相关。

EBV与胃癌、乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等肿瘤相关［12］，与鼻咽癌发病关系更为密切。不同EBV株的生物学特性也指向了不同类型的癌症［13］。尤其是在未分化型鼻咽癌中，90%以上呈EBV阳性［14］。已有学者提出，可利用EBV特异性抗体和EBV DNA来诊断早期鼻咽癌，且EBV感染后的特异性病理学改变有助于鼻咽癌病理学的诊断［15］。Ji MF等［16］对广东省825例高风险患鼻咽癌者行EBV DNA检查，1年内诊断鼻咽癌的敏感性为86.8%，特异性为90%。因此，用血清EBV评估的基础上联合EBV DNA检测可明显提高筛查的准确率。卢煜明教授及其研究团队研究［17］发现，检测EBV DNA对诊断鼻咽癌的敏感性和特异性分别为97.1%和98.6%。王琳等［18］检测EBV DNA结果显示高危人群的阳性率为12%，低危人群的阳性率为3.4%，临床初诊为鼻咽癌的患者EBV DNA阳性率为91.4%。鼻咽癌患者血清中大多有EBV抗体效价升高，且效价水平常与病变好转或恶化呈正相关。Meng C等［19］研究报道放疗前血浆EBVDNA阳性患者在放疗后2年无病生存率为80.8%，而EBVDNA阴性患者2年无病生存率为98.4%，差异有统计学意义。Lo YM等［20］研究证实，放疗后血浆中EBV DNA中位半衰期为3.8天，如放射治疗后检测EBV DNA持续阳性或再次升高往往提示肿瘤未控或进展。EVB DNA对早期鼻咽癌分期有一定指导作用。在AJCC鼻咽癌临床分期（第8版）［5］中，若颈部淋巴结转移癌伴EBV DNA阳性，即使鼻咽部未发现肿瘤，亦定义为T0期鼻咽癌［21］。

综上所述，血清EBV DNA检测对于鼻咽癌的诊断、治疗疗效及预后都有非常重要的指导作用。临床中我们发现大多数EBV DNA阳性患者的免疫功能出现不同程度下降。Chung BK等［22］研究表明，免疫功能正常的个体被EBV感染后会进入休眠状态，但病毒仍能够持续在人体内通过EBV编码的小RNA和病毒micro-RNA来表达病毒产物。免疫功能低下的个体感染后，EBV在淋巴组织中大量增殖，并可异位感染T细胞与NK细胞等，导致宿主免疫系统功能紊乱。多项研究提出，除传统影像学随访外，EBV DNA滴度的定量检测可用于监测鼻咽癌局部复发和转移，滴度越高，越容易复发和转移［23-25］。现临床已将EBV DNA视为鼻咽癌患者肿瘤标志物，阴性、阳性及阳性数值的高低可指导临床治疗。