Y染色体微缺失与男性少弱精子症相关性研究进展

王一鹏 秦 朗 李 颖

目前，不孕症影响着全球15%的夫妇，其中男性因素约占50%。引起男性不育的原因主要包括生精障碍、输精管道梗阻(感染性/输精管缺如)、性腺附属器官异常、性功能异常、全身性疾病、应用某些药物或接触毒物及放射线等。男性不育因素中以生精障碍最为常见，临床表现为无精子症和少弱精子症，约30%的生精障碍患者存在遗传学异常，包括性染色体数目异常(如47,XXY克氏征)、某些常染色体基因突变以及Y染色体结构或基因异常，而后者是15%的少精子症或无精子症患者发病的遗传因素[1]。男性生殖遗传学检查对于指导临床治疗、提高辅助生殖技术的有效性和安全性、开展胚胎植入前遗传学检测(preimplantation genetic testing, PGT)等具有重要意义。

一、男性AZF基因微缺失是造成生精障碍的主要遗传学因素

Y染色体的雄性特异性区域(male-specific region of the Y chromosome, MSY)是男性独有的基因区域，该区域通过转录、基因沉默、泛素化等影响精子发生。MSY区域内包含大量高度同源的回文序列和发夹结构，这些结构间发生频繁的基因转换引起非等位同源性重组(non-allelic homologous recombination, NAHR)。NAHR是防止Y染色体遗传衰减的机制之一，但也会因此导致该区域内较高的基因缺失率。5%～10%的无精子症患者和2%～5%的严重少精子症患者是由于MSY区域内的基因缺失，即Y染色体微缺失(Y-chromosome microdeletions, YCMs)导致[2]。除精液异常外，YCMs还可能与睾丸及附睾发育异常、精索静脉曲张、生殖激素异常等不育因素有关。

1976年，Tiepolo等[3]在6例无精子症患者中，发现Y染色体q11.2区域的缺失，并将该区域命名为男性少弱精因子(azoospermia factor，AZF)区域。研究者根据Yq11在无精子男性生殖细胞发育不同阶段的作用，将76个离散的“微缺失”位点定位到Yq11的3个亚区，它们被命名为AZFa(近端)，AZFb(中段)和AZFc(远端)，各个区域均存在导致男性精子生成障碍的候选基因[4]。2015年中华医学会男科学分会发布的《男性生殖遗传学检查专家共识》中提出，男性生殖疾病诊治中应进行染色体核型分析、AZF基因微缺失等常规检查以及基因突变检测等特殊检查[5]。

二、YCMs的流行病学

20多年来，全球范围内多采用巢式或多重PCR进行YCMs的检测，不同报道的YCMs检出率存在差异。美国生殖医学协会(American society for reproductive medicine，ASRM)2012年在男性不育的诊疗共识中发布，一般男性人群中YCMs的发生率可能为2%[6]。但欧洲男科学会(European academy of andrology，EAA)认为YCMs在普通男性人群中的发生率要低得多，约为1/4000(0.025%)[7]。另一项对超过10000例的Meta分析显示，5%北美严重少精症(精子数≤1×106/ml)患者存在AZF微缺失，而精液正常男性的发生率则不到1%，研究者认为AZF的缺失是与生精失败相关的，北美和欧洲的男性不育指南建议只对精子浓度为≤1×106/ml的男性进行YCMs检测[8]。

在既往的报道中，不育男性的YCMs检出率存在显著的地理区域和种族差异，AZF缺失率从美国的12.0%和伊朗的24.2%到德国和奥地利等国的不到2.0%[9]。2019年的一项研究对1030例不育的日本男性进行了YCMs筛查，严重少精症或无精症男性中YCMs近7%(包括所有AZF重排)，AZFc是最常见的缺失区域[10]。

三、YCMs检测的临床意义

1.AZF分区：Y染色体AZF区包括a、b和c等3个区域，这3个区域内含有多种精子生发相关基因，不同区域出现微缺失时均有可能通过影响相关基因造成少弱精症。目前主要通过检测序列标签位点(sequence tag site，STS)判断AZF区域缺失部位。2012年欧洲男科学会发布的的Y染色体微缺失检测专家共识提出，应检测6个STS位点以检测AZF基因微缺失，这6个STS位点分别为AZFa区的sY84、sY86，AZFb区的sY127、sY134及AZFc区的sY254、sY255，该专家共识一直沿用至今[11]。然而，由于基因变异存在人种以及地域差异，上述6个STS位点并不完全适合中国人群。2015年中华医学会男科学分会发布的《男性生殖遗传学检查专家共识》中，将Y染色体AZF微缺失检测位点扩增为8个，在欧洲共识的基础上增加了AZFc区sY145及sY152位点的检测[5]。

在临床工作中，YCMs检测在评估男性不育症和低生育能力中至关重要，往往影响临床决策和辅助生殖技术的实施路径。在AZFa、AZFb和AZFc缺失中，AZFc缺失是最常见的YCMs，占所有报告缺失的60%～80%[7]。

2.AZF各区候选基因及辅助生育策略：AZFa区的候选基因有USP9Y、DBY和UTY基因，目前临床共识推荐sY84及sY86为AZFa区基因微缺失的检测位点。AZFa区基因发生微缺失会导致唯支持细胞综合征，临床表现为睾丸体积的缩小和无精子症等[12]。由于AZFa区包含着精子生成必需的基因，AZFa缺失确诊意味着即使采用包括显微穿刺取精术(microdissection testicular sperm extraction，mTESE)在内的所有取精手术都不能获得精子，建议患者供精人工授精(artificial insemination by donor，AID)。

AZFb区主要候选基因有RBMY1、EIFA1Y、HSFY和PRY等基因，目前临床共识推荐sY127及sY134为AZFb区基因微缺失的检测位点。AZFb+c缺失会导致唯支持细胞综合征或精子发生阻滞，患者多为无精子症，故建议AZFb完全缺失(含AZFb+c缺失)的患者AID[13]。

AZFc区与少弱精症相关的候选基因较多，有DAZ、BPY2、CDY1、CSGP4LY和GOLGA2LY等，目前临床共识推荐sY145、sY152、sY254及sY255均为AZFc区基因微缺失的检测位点。AZFc区候选基因中以DAZ基因家族最为重要， DAZ基因家族包含4个DAZ基因(DAZ1～4)，其功能是靶mRNA转运的适配区和翻译的激活区[14]。DAZ基因家族缺失是AZF微缺失中最常见的类型，特发性无精子症及严重少精子症患者中涉及DAZ缺失的比率分别为13%和6%[15]。

3.AZFc缺失患者体外辅助生育策略的选择及预后：AZFc缺失患者的表型具有较高差异，无精、少精均有可能，由于仍存在产生正常精子的可能，AZFc缺失患者可能是唯一可获得自身后代的YCMs患者。AZFc缺失的无精子症患者，可以试行睾丸取精术以获得精子，并通过行卵胞质内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)进行体外辅助受孕。而对于AZFc缺失合并严重少精子症患者，可以选择直接ICSI。

有研究发现AZFc区域缺失的少精子症患者，其精子数目有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症。因此，对此类患者建议及早生育或冷冻保存精子[16]。近年来有研究发现AZFc微缺失对ICSI结果有不利影响，AZFc缺失组ICSI结局较差，累积临床妊娠率(45.39% vs 67.49%)、累积活产率(35.15% vs 53.44%)、受精率(46.80% vs 53.37%)，植入率(28.63% vs 31.26%)均低于Y染色体正常组[17]；即使采取了mTESE，AZFc微缺失的无精子症患者的ICSI结果比无AZF缺失的男性更差[18]。近年来开展的对12项研究的Meta分析总结了YCMs对ART妊娠结局的影响，发现与正常组比较，YCMs组受精率显著降低(P=0.0006)，优质胚胎率、临床怀孕率、早期流产率、流产率、活产率差异无统计学意义，认为YCMs与ART的受精率降低有关[19]。

mTESE被认为是治疗男性非阻塞性无精子症的“金标准”，大约有52%的精子获取成功率，然而YCMs男性成功取出精子的概率很可能取决于AZF缺失的区域[20]；AZFc区缺失患者的精子获取率大约为50%～80%，是YCMs中最高的，而AZFa和AZFb区缺失的患者就有极差的精子获取率和临床结局，多AZF区域缺失如AZFbc和AZFabc缺失，也同样有很差的精子获取结果[7，8，10]。因此，检测YCMs位置和程度，对ART助孕策略和临床决策的制定意义重大。基于之前极低的精子获得率，对于AZFa、AZFb、AZFabc或AZFbc缺失的患者不推荐进行mTESE[7]。

对于拟行ART的AZFc缺失患者建议进行遗传筛查和咨询，其男性后代都将继承他们父亲带有微缺失的Y染色体，这些男婴的不育程度将和他们的父亲一样，甚至更严重。此外，Y染色体微缺失是Y染色体结构不稳定的表现之一，AZF缺失患者男性后代罹患Turner综合征(45,X)和两性畸形可能性增大，故应建议胎儿进行产前诊断行染色体核型分析。对于拟行ART的AZFc微缺失患者，可以进行PGT，选择女婴植入或者考虑供精[8]。

四、YCMs的检测方法

已发现的AZF区基因微缺失相关STS位点达数百个，各STS位点对应AZF的不同区域。国内现有的AZF微缺失临床检测试剂多遵循欧洲专家共识，检测sY84、sY86、sY127、sY134、sY254及sY255这6个STS位点[7]。可用于检测AZF区域微缺失方法包括多重PCR、实时荧光PCR、基因芯片等。

1.多重PCR法：多重PCR结合琼脂糖凝胶电泳是EAA/EMQN制定的标准方法，具有以下优点：经济简便性，多个目的基因在同一反应管中被检出，将大大节省时间，节省试剂成本；快速高效性，在同一PCR反应管内同时对多个目的基因进行分型；系统性，多重PCR适宜于成组检测[7]。但是多重PCR的局限性在实验中也凸显出来，相对于常规PCR有更高的技术要求，例如针对每一个缺失位点都要设计单一引物，前期程序复杂，容易引起假阴性和假阳性结果。而且琼脂糖凝胶电泳分辨率较低，无法分辨相对分子质量相对接近的STS位点，如EAA/EMQN推荐检测的6个STSs中，有两组相对分子质量接近的STS，分别是sY127(274bp)与sY134(301bp)，sY84(326bp)与sY86(320bp)，以上位点在琼脂糖电泳条件下很难在一个泳道分离。因此EAA/EMQN在推荐的检测方法中，建议把这些STS分成两组检测，同时长时间电泳确保分辨率，导致实验耗时，增加工作量。

2.荧光定量PCR法:荧光定量PCR法是临床AZF缺失检测试剂盒常用的检测方法。作为临床检验中最常用的分子生物学手段，荧光定量PCR法的检测敏感度和可靠性已经过长时间的临床验证。但是，由于荧光定量PCR技术只有对应FAM、VIC、ROX及Cy5 4种荧光染料的检测通道，每个检测体系最多可检测3个检测指标+1个质控指标。以现有针对欧洲共识6个STS位点进行检测的试剂盒为例，每例样本检测需至少准备2个扩增体系，如对我国共识所推荐的8个STS位点进行检测则需要准备3个甚至4个扩增体系。随着对人Y染色体生精相关基因的深入研究，男性生精相关基因STS检测位点还可能进一步增加，数量过多的扩增体系会显著增加操作难度及污染风险，造成质量控制难度大幅增加[5]。

3.其他检测方法：尽管高通量测序(next-generation sequencing, NGS)技术在临床基因检测中越来越受到欢迎，但由于Y染色体结构的特殊性，现阶段不适合将WGS应用于YCMs筛查。大多数致病性YCMs广泛分布在Y染色体常染色质的扩增子区，用PCR扩增来筛选STS位点更适合于鉴定这些缺失[21]。随着分子生物技术的进展，基于基因芯片的基因微缺失检测技术日渐成熟，以基因芯片技术将逐步取代需要建立多个扩增体系的PCR技术进行多基因位点检测。该方法将PCR与分子杂交技术结合，具有自动化、集成化、微量化、高通量等优点，在实验室间推广。

五、YCMs的筛查策略

ASRM和EAA/EMQN等专业协会发布指南建议对严重少精症(精子数量<5×106/ml)的男性进行筛查[7]。然而最近的研究表明筛查阈值可能需要调整。Kohn等[8]开展的Meta分析发现，精子数量为1×106/ml ～5×106/ml和5×106/ml ～20×106/ml的YCMs发生率比较，差异无统计学意义；而在精子数量为0～1×106/ml和1×106/ml ～5×106/ml的男性中，YCMs的发生率比较，差异有统计学意义(P=0.001)，因此建议将检测的阈值降低到精子数1×106/ml以下。Johnson等[22]回顾性研究发现，以精子数5×106/ml为筛选阈值具有100%的敏感度和13%的特异性；将该阈值降低到1×106/ml仍具有100%的敏感度，但特异性提高到24%。进一步降低到0.5×106/ml可以再增加特异性，由于精子数为0.5×106/ml ～1×106/ml的男性患者YCMs的发生率相对较高，所以仍推荐1×106/ml作为筛查阈值[23]。

研究表明，在建立更好的男性少弱精症基因筛查和诊断策略前，需要开展更多研究来寻找本效益比和医学收益上比较适当的阈值，后续指南应建议更新筛查标准，包括更低的筛查阈值和考虑其他变量，以便更加合理地进行筛查。