Notch受体家族与心肌重构的研究进展

袁雨培综述 唐其柱审校

据《中国心血管病报告2018》报道，我国心血管疾病现患人数2.9亿，其中高血压病2.45亿例，心力衰竭450万例[1]。心力衰竭是高血压、冠心病、心肌病等多种心血管疾病的最终结局，尽管目前临床药物和器械辅助治疗可延缓心力衰竭进程，心力衰竭患者的总体预后仍很差。心肌重构贯穿心脏损伤的始终，是心血管疾病进展为心力衰竭必然经历的病理生理过程。心肌重构是指心脏在损伤或血液动力学异常时，从基因到结构的重建，最终导致心脏大小、形状和功能发生改变。心肌重构过程中，间质发生纤维化，降低心脏顺应性，影响心脏的舒张功能；心肌细胞凋亡，数目减少，影响心脏的收缩功能。胶原纤维包裹心肌细胞导致电传导障碍引发恶性心律失常；心肌细胞肥大导致血管密度相对降低，引发心肌缺氧。因此，需要深入研究心肌重构的分子调控机制，以发现心肌重构和心力衰竭治疗的新靶点。

对于心肌重构虽已进行了大量的研究，但其具体发生机制仍不十分明确，心肌细胞及其他非心肌细胞(成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等)的凋亡或增殖，心肌的炎性反应、氧化应激反应，纤维化及心肌内血管生成等均被证明参与了心肌重构发生发展[2-4]。而近期研究发现，Notch家族蛋白可参与调节上述多种过程，可能对心肌重构发挥作用[5-6]。因此笔者结合最新研究，对Notch家族蛋白与心肌重构的研究进展进行综述，以期为进一步探究提供更多理论依据。

1 Notch受体家族概述

Notch受体家族是一种高度保守的膜蛋白受体家族，在哺乳动物中包含4个同源受体，即Notch1～4。Notch最早由Morgan在突变的果蝇中发现，该基因的功能缺失会导致果蝇翅膀边缘出现缺刻，后研究发现Notch也广泛表达于脊椎动物、哺乳动物等多个物种中。Notch受体分子量为300 kD左右，由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区包含数个表皮生长因子样重复序列及保守的富含半胱氨酸位点，主要功能是和配体结合，激活Notch信号通路产生效应；胞内区包含1个RAM序列、6个CDC10/锚蛋白样重复序列、2个核定位信号、1个转录激活区及1个PEST序列，主要功能是将Notch信号转到细胞核内。邻近细胞的Notch胞外区与配体结合，在肿瘤坏死因子α转换酶、γ-促分泌酶作用下发生2次蛋白裂解，形成可溶性Notch胞内区活化形式(intracellular domain of Notch，NICD)进入细胞核，与初级转录因子CSL结合，启动下游靶基因的表达。高等动物Notch下游靶基因为Hes和Hey。除了CSL经典通路外，Notch还被证明可以通过非CSL依赖的方式激活，如丝氨酸/丝氨酸特异性蛋白激酶的激活[7]。

目前对Notch信号通路的研究涉及胚胎的发育、免疫系统功能调控、肿瘤的发生、神经退行性变及炎性反应等病理生理过程。心血管方面，Notch的表达可在胚胎期心脏检测到。其中Notch1主要表达于心脏的流出道、房室管、室壁小梁及心外膜，Notch2主要表达于房室管、肺动脉及主动脉，Notch3主要表达于肺动脉和主动脉，Notch4主要表达于主动脉内皮。Notch1～3均在胚胎第11天开始有表达，12周期间达到峰值，Notch4起始表达量低，2周时达到高峰。Notch家族受体的表达参与调控心脏各部位的形成，在心脏发育中发挥重要的作用；其信号的缺失会导致各种先天性心脏病的发生[5]。Notch受体家族在心脏发育中的作用已得到广泛探究，但在成人心脏中的作用研究尚未完全明确。

2 Notch受体家族与心肌重构

现有研究显示，在导致心肌重构的不同疾病模型中，Notch受体家族各成员均参与了各种心肌重构的发生过程，发挥不同的作用。

2.1 Notch1受体与心肌重构 心肌重构是在炎性反应、氧化应激或机械应力等刺激下，心肌细胞及其他非心肌细胞发生凋亡。而抑制各种刺激因素，减缓细胞凋亡的发生可有效地抑制心肌重构的进展。Rocca等[8]研究显示，缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)会导致大鼠心肌损伤，心功能恶化；但激活Notch1后梗死面积减小，大鼠心功能明显好转。体外实验显示，Notch1过表达可降低心肌细胞凋亡率，即Notch1的心肌重构保护作用可能是通过抑制细胞凋亡发挥的。同样地，Du等[9]研究显示，小鼠心肌梗死(myocardial infarction, MI)模型组相对于对照组，Notch1及其活性成分N1ICD的转录及表达水平增加。而使用Notch1的激活剂后，心脏中丙二醛及一氧化氮合酶的含量明显降低，凋亡阳性细胞数目及Caspase3的表达水平降低，即心肌中氧化应激反应及凋亡水平降低；心肌损伤标志物水平下降，心功能好转。由此证明激活Notch1可通过抑制心脏内氧化应激水平并进一步减少细胞凋亡发挥保护作用。而抑制Notch1后，上述保护作用消失，氧化应激反应及凋亡程度上升。Yang等[10]发现激活Notch1可通过抑制炎性反应的发生保护心肌，具体表现为Notch1可减少因MI导致的炎性因子如白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、单核细胞趋化蛋白-1和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的转录及表达增加，减少心肌内巨噬细胞浸润，进一步抑制细胞凋亡，恢复心功能。

Notch1还被证明可通过抑制心肌重构的关键过程——心肌纤维化来调控心肌重构的发展。在转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)刺激的成纤维细胞中，过表达Notch1后可观察到成纤维细胞的增殖被明显抑制，成纤维标志物Ⅰ型胶原表达减少，且进一步机制探究显示Notch1的这一作用是通过抑制纤维化相关通路TGF-β1/Smad发挥的[11]。在大鼠MI模型中，Notch1也被证实可与TGF-β1/Smad3通路相互拮抗，Notch1抑制TGF-β1及Smad3的激活，抑制纤维化标志物的产生，减少成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，MI大鼠心肌纤维化减少，减轻心肌重构的发生[12]。另外，在阿霉素(doxorubicin，DOX)导致的斑马鱼心脏损伤模型中，Notch1也被发现可以减少DOX导致的心肌纤维化，主要是通过抑制纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、TGF-β1以及结缔组织生长因子的表达，并可进一步减少细胞凋亡[13]。

最新研究显示，Notch1还与心脏中血管的生成密切相关。Liu等[14]发现Notch1可增强MI模型大鼠的心功能，具体表现为侧支循环血流量及心肌灌注增加，缺血心肌的体积减小；进一步对血管密度进行检测发现，Notch1激活增加了微循环的血管数量及大小。Zhao等[15]研究表明，Notch1可促进血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子表达，进一步促进新生血管成熟，增加缺血心肌的局部血流，说明Notch1可通过调控心脏内血管的生成及成熟对抗心肌重构的发生。Notch1还被证明与内质网应激有关，Zhang等[16]发现在I/R小鼠心肌重构模型中，过表达Notch1可抑制内质网应激关键酶蛋白，如激酶R样内质网激酶、α亚基的真核起始因子2及C/EBP同源蛋白的激活或表达，进一步减少细胞凋亡，缓解心肌重构的发生，改善心功能。

另外，间充质干细胞(mesenchymal cells，MSC)的激活、增殖和迁移对于心脏损伤的修复有重要作用；且有研究显示，心力衰竭患者的脂肪间充质干细胞中Notch1表达明显下调[17]。而最新研究显示，MI模型小鼠中，Notch1可通过介导血清外显体的表达，促进内源性间充质干细胞的激活，促进VEGF的表达及血管生成，有助于心脏损伤修复[18]。

2.2 Notch2受体与心肌重构 现已有大量研究证明，Notch2在心脏发育中的作用至关重要，它参与心肌细胞的增殖、分化和凋亡等过程，敲除Notch2可能会导致心肌肥厚、致密化减少和室间隔缺损等问题[19-21]。但其在成熟心脏中的作用研究较少。Richard等[22]研究显示，小鼠I/R损伤后，心脏中Notch2转录水平相对于假手术组明显下降；外源性给予二十二碳六烯酸激活Notch2后，心肌梗死面积减小，氧化应激水平降低，心脏耗氧量、ATP消耗及肌酸激酶的释放均减少，即Notch2的表达可通过调控氧化应激发挥心脏保护作用。另外，在猪慢性缺血心脏损伤模型中，高脂饲料喂养组相对于正常饲料组Notch2的表达下降，细胞凋亡增加，免疫荧光显示Notch2的表达高度集中于平滑肌壁，与平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)共定位。但与对照组相比，心脏毛细血管密度无明显差异，说明Notch2的促血管生成功能还有待进一步探究[23]。另有研究显示，Notch2的激活不仅可以调节血管平滑肌细胞的增殖与凋亡，还可促进血管内皮细胞生成细胞球蛋白，加强平滑肌细胞对一氧化氮的利用，进一步促进血管功能；Notch2也可能通过对血管内皮细胞及平滑肌细胞的调节发挥心肌重构抑制作用[24-25]。除了发挥保护作用，Notch2的表达还被证明可促进心肌纤维化的发生。Geng等[26]研究显示，在高糖刺激的人主动脉瓣内皮细胞中，相对于对照组细胞，Notch2的表达明显上调，内皮间质转化增加，纤维化标志物如α-SMA、FN和波形蛋白等表达增加；而给予microRNA-18a-5p抑制Notch2的表达后，内皮间质转化减少，纤维化标志物减少。在糖尿病心肌病大鼠模型中，Notch2的表达抑制使内皮间质转化及心肌纤维化减少，心功能好转。由此说明，Notch2对于心肌重构的作用可能存在两面性，具体作用及机制还有待更进一步探究。

2.3 Notch3受体与心肌重构 在离体大鼠心肌细胞中，Notch3被证明是Notch受体家族的主要表达受体，且在慢性心力衰竭模型中，Notch3的转录水平升高，且表达水平升高更为显著[27]。Zhang等[28]研究发现，小鼠I/R损伤模型中，Notch3可被肿瘤抑制素M激活，Notch3表达增加可减轻I/R造成的损伤，具体表现为Notch3激活组小鼠心肌损伤标志物乳酸脱氢酶和肌酸激酶同工酶明显降低，心肌梗死面积减小，心脏射血分数增加，心脏中ROS水平及线粒体中锰超氧化物歧化酶活性降低，心肌细胞凋亡减少。更为重要的是，Notch3减轻了I/R导致的小鼠线粒体结构紊乱，增加了其生物合成，主要通过提高小鼠缺血心肌线粒体ATP含量，增强柠檬酸合酶活性及呼吸链复合体Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ/Ⅴ的活性。细胞实验进一步验证了Notch3的上述作用，证明Notch3过表达可明显缓解心肌重构，相反地，抑制其表达会加重心肌重构。进一步研究发现，Notch3的这一心脏保护作用是由PI3K/AKT通路介导的。另有研究显示，Notch3可被apelin干预激活，进一步促进骨髓细胞的招募，抑制MI导致的小鼠心肌活性氧的生成增加及心肌细胞凋亡，增强心功能[29]。

Notch3还与心肌纤维化密切相关。在小鼠心肌梗死24 h后，Notch3表达迅速增加。与单纯MI小鼠相比，过表达Notch3的小鼠心功能好转，存活率升高，而沉默Notch3的小鼠心功能恶化，存活率降低。过表达Notch3可明显抑制心脏内纤维化标志物α-SMA、Ⅰ型胶原、金属蛋白酶组织抑制剂-2的转录和表达；且Notch3激活后p-Smad3表达降低。体外实验中，过表达Notch3可抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，同时也验证了这一作用是通过抑制TGF-β1/Smad3信号通路实现的[30]。施建丽[31]研究也显示，Notch3可抑制心脏成纤维细胞增殖及向肌成纤维细胞转化，提示Notch3是通过抑制RhoA/ROCK/Hif1α轴发挥对抗心肌纤维化并改善心功能的。

另外，研究还发现Notch3与心脏血管生成密切相关。Ragot等[32]发现Notch3敲除的小鼠在基础水平即表现出心肌肥厚和纤维化，加入血管紧张素2干预后，出现明显的心力衰竭：心脏扩张，左心室短轴缩短率降低，心脏损伤标志物表达升高。导致这一结果的原因是，Notch3的敲除使心肌细胞及血管平滑肌细胞凋亡增加，纤维状肌动蛋白水平下降，纤连蛋白增加，同时血管平滑肌细胞从收缩表型向合成表型转变，血管生成减少。毛细血管稀疏引起心肌细胞的需求和供给不平衡，引起氧化应激、炎性反应和纤维化。具体表现为心肌内活性氧、还原型辅酶氧化酶Ⅱ、巨噬细胞浸润、纤维化标志物转录水平(ColⅠ、ColⅢ、FN)均明显增加。由此证明，Notch3还可通过调节血管生成对抗心肌重构的发生。另一研究也显示，小鼠MI模型中，Notch3可影响微血管的功能及成熟。相对于野生型小鼠，敲除Notch3小鼠的周细胞/毛细血管覆盖率下降，小动脉成熟减少；虽然对心功能无明显影响，但脉冲多普勒显示左冠状动脉舒张期峰值血流速度显著降低，冠状动脉血流储备明显下降。且Notch3敲除小鼠在结扎左冠状动脉前降支后，引起心肌梗死面积更大、心功能更差、病死率更高。Notch3促进血管生成的作用是通过增加VEGF及血管生成素-1的表达发挥的，VEGF及Ang-1表达减少影响心肌缺血后小动脉的形成，使Notch3敲除小鼠平滑肌细胞覆盖不规则，小动脉壁不完全，新生血管发育不成熟；更进一步导致心脏中炎性反应和细胞凋亡的发生[33]。

另外，Xu等[34]发现在缺氧处理的H9C2细胞中，MicroRNA-1过表达可抑制Notch3激活，同时造成细胞凋亡增加，增殖和自噬减少；证明Notch3的激活可促进心肌细胞增殖和自噬，减少凋亡。也有研究显示，Notch3的缺失会影响内皮细胞与周细胞的通信，导致周细胞容易脱离并迁移到血管周围间质中分化为成纤维细胞，这一过程导致血管通透性增加，炎性反应增加，心肌纤维化加重[35]，说明Notch3的表达还可能通过对维持周细胞的稳定性发挥对抗心肌重构的作用，但具体机制还有待进一步探究。

2.4 Notch4受体与心肌重构 一项回归分析显示，Notch4基因中的T等位基因rs3134942可增加人群患扩张型心肌病的风险[36]。在糖尿病合并心肌梗死的大鼠模型中，肌酸激酶同工酶、心肌肌钙蛋白T水平升高，梗死面积增加，心肌细胞凋亡增加，同时，Notch1和Notch4的转录及表达水平被明显抑制；在细胞水平激活Notch通路，使Notch1、Notch4表达增加，高糖及缺氧引起的心肌细胞存活率降低和凋亡增加均被明显抑制[37]。由此证明，Notch4可通过抑制心肌细胞凋亡，对心肌重构发挥一定的保护作用。另外，Notch4还被证明可被其配体DLL4调节，参与内皮细胞与巨噬细胞的浸润与分化，与心肌内炎性反应的形成密切相关[38]。由此证明，Notch4与血管内皮细胞关系密切，可通过调节其增殖、迁移及凋亡，并参与内皮细胞与其他细胞的相互作用，调节各种刺激下的心肌炎性反应，抑制心肌重构的发生。另外，Elmadhun等[23]研究发现，在已构建代谢综合征(metabolic syndrome，MS)的奥萨博猪中构建慢性心肌缺血模型，结果显示MS会抑制Notch4的表达，增加心肌细胞凋亡；但小动脉计数及毛细血管密度在MS组和对照组间无明显差异，即Notch4的表达对血管生成无明显影响。但与上述结果不同，James等[39]证明Notch4与小鼠发育过程中微血管丛的生成关系密切，但并未探究其对成年小鼠血管生成的作用；这可能是由于Notch4在不同阶段的作用不同，有待进一步探究。

3 小 结

Notch受体家族作为心脏发育重要的成分，已被证明可通过抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗纤维化、促血管生成等多种方式调控心肌重构的发生。虽大量研究显示其在抑制心肌重构中的积极作用，但也有研究显示部分成员在不同疾病模型中发挥促进作用，且发挥作用的具体机制尚不十分清楚。Notch受体家族特异性激动剂或抑制剂的进一步使用仍需要进一步评估。因此深入探究Notch受体家族与心肌重构的关系，探寻相关的分子作用机制，早日发现组织选择性或靶基因选择性的Notch激动剂或抑制剂对心血管疾病的防治具有深远意义。