流感病毒阳性毒株增毒的影响因素

孟淑娟

辽宁省朝阳市疾病预防控制中心微生物检测所 122000

流感是全世界最严重的呼吸道传染病之一，其发病率极高，因此流感是第一个实现全球监控的传染病。流行性感冒病毒是正黏病毒科的代表种，简称流感病毒，包括人流感病毒和动物流感病毒，人流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒(流感)的病原体。甲型流感病毒常以流行形式出现，引起世界性流感大流行，它在动物中分布广泛，并也能在动物中引起流感流行和造成大量动物死亡。乙型流感病毒常引起流感局部爆发，不引起世界性流感大流行。丙型流感病毒主要以散在形式出现，主要侵袭婴幼儿，一般不引起流感流行。流感在流行病学上最显著的特点为：突然爆发，迅速蔓延，波及面广，具有一定的季节性，一般流行3～4周会自然停止，发病率高死亡率低，多发于青少年，恢复快，一般不留后遗症，每次流行后都要在人群中造成不同程度的超额死亡，因此流感在疾病预防控制中是一项非常重要的常规监测项目。目前我国省市级流感监测实验室常采用MDCK细胞分离培养技术来分离流感毒株，对流感的型别进行鉴别，以便更好地掌握流感的流行病学特点，也同时为流感疫苗的制备提供依据[1]。该文主要通过MDCK细胞分离培养技术来分析流感病毒阳性样本在增毒过程中的影响因素，从而提高流感组织培养技能，为疫苗制备提供更充足的理论依据。

1 材料

1.1 细胞 细胞由辽宁省疾病预防控制中心提供。一般采用MDCK细胞进行病毒分离培养，一般选取30代以内的细胞，30代之后的细胞由于敏感性下降，对流感病毒已经不敏感，不建议使用。如果情况特殊需要使用，需要做TCID50敏感性测定。

1.2 试剂 DMEM培养液及小牛血清试剂购于美国Gibco公司，青霉素链霉素混合剂(PS)、胰酶-EDTA、PBS、牛血清白蛋白组分V(ALB)购于以色列BioInd公司，TPCK胰酶购于美国SIGMA公司，流感病毒标准血清由国家疾控中心提供。豚鼠血红细胞悬液由朝阳市卫生健康事业服务中心流感实验室制备。生理盐水购于山东科伦药业有限公司。

1.3 样本 样本来自2017年9月—2020年3月辽宁省朝阳市中心医院发热门诊的流感样病例(发热、腋下体温≥38℃，伴咳嗽或者咽痛且未服用过抗病毒药物的患者，采样时间距离就诊时间不超过3d)，且经PCR实验室检测流感病毒核酸阳性的115份样本。

2 方法

2.1 MDCK细胞分离流程 用40倍镜观察细胞生长状态，选择处于对数期的MDCK细胞进行分离培养。将细胞板用PBS清洗3次，然后将200μl的样本接种到24孔细胞板，然后加入配置好的病毒生长液，放入CO2培养箱中培养。如果是第1次上样应将样本接种后放入温箱孵育1.5h，然后取出细胞板用PBS清洗3次再加入病毒培养液。观察细胞病变，记录每天细胞的病变情况，当出现明显病变时进行收获，如果没有病变也应在第7天收获。收获后进行红细胞凝集实验(HA)，HA滴度达到1∶16时进行红细胞凝集抑制实验(HI)，HA滴度没有达到1∶16则继续进行增毒，一般增毒3次或者4次还没达到滴度需要重新上样，防止增毒次数太多导致病毒变异。

2.2 样本处理 实验室收到样本后，需进行处理后再进行病毒分离接种。先将含聚丙烯纤维的拭子在管壁反复挤压后取出，然后将标本分成3份，每份1ml。1份用于鸡胚培养，1份用于MDCK细胞分离培养，1份用于保存待复核。

2.3 TPCK胰酶的最佳浓度 选取PCR检测阳性样本115份，等量接种到24孔细胞板中，然后每个孔分别加入胰酶(2mg/ml TPCK)终浓度为1、2、3、5、10μg/ml的病毒维持液，采用相同条件放入CO2培养箱，每日观察细胞状态，当出现明显的细胞病变时进行收获，一般72h会出现明显的细胞病变，此时可以进行病毒液收获。

2.4 流感病毒最佳增值代数 选取PCR检测阳性样本115份，将115份样本分5次以200μl接种到生长成致密单层的MDCK24孔细胞板，然后每次收获之后连续传6代，每一代收获病毒液之后测定HA的滴度并记录每一次HA实验结果。

2.5 病毒液最佳稀释倍数 选取PCR检测阳性样本115份，每次上样后记录HA滴度。HA滴度为1∶1的样本13份，HA滴度为1∶2的样本26份，HA滴度为1∶4的样本有61份，HA滴度为1∶8的样本15份。选取61份HA滴度1∶4 的样本，分别以1∶1、1∶100、1∶200、1∶500进行稀释。将稀释后的样本分别接种200μl到24孔细胞板，放入温箱培养，每日观察细胞状态，当出现明显的细胞病变时进行收获，一般72h会出现明显的细胞病变，此时可以进行病毒液收获。

3 结果

3.1 TPCK胰酶的最佳浓度 维持液中加入适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中感染性，能促进流感病毒空斑的形成，加大空斑面积。因为只有血凝素(HA)是裂解型的流感病毒，其毒粒才具有感染性。细胞培养不同于鸡胚培养，它的维持液中不存在蛋白水解酶，无法将病毒粒非裂解型的HAO变成裂解型的HA1+HA2，故必须要在维持液中加入适量的胰酶，实验中发现胰酶在维持液中终浓度为2.5mg/ml时病毒液的HA滴度会明显提高。

3.2 流感病毒增值最佳代数 根据HA实验结果比较发现，在病毒接种之后进行第3次传代增毒的时候，HA的滴度最高，有62份样品HA滴度均达到1∶32，其余48份样品HA滴度也能够达到1∶16，只有5份样本HA滴度低于1∶16。而第1代仅有12份样本HA滴度1∶8，其余103份样本HA滴度均低于1∶8，第2代有38份样本HA滴度1∶16，其余77份样本HA滴度均低于1∶16。当进行到第四次细胞接种增毒之后，发现滴度明显下降，甚至出现没有滴度的情况，说明病毒增毒的最佳代数是在进行第3次传代增毒，所以我们在增毒过程中一般以3代为主，再继续传代不仅滴度下降，还有可能使病毒产生变异。

3.3 病毒液最佳稀释倍数 实验发现，病毒在第1次接种培养之后有53%的样本HA滴度可以达到1∶4，需要继续传代细胞进行接种，当流感病毒毒力太强，接种到细胞上容易引起细胞提前脱落，不能够有效增殖。在61份滴度达到1∶4的样本中有38份都在1∶200的稀释倍数时获得的滴度均>1∶16，其他23份样本有5份样本在1∶1稀释倍数时、13份样本在1∶100稀释倍数时、5份样本在1∶500稀释倍数时获得的滴度>1∶16，故一般1∶4滴度的病毒液应该按1∶200比例进行稀释后是最适合病毒在MDCK细胞上增殖，这样我们可以及时对样本进行准确的稀释来提高HA滴度，获得更多的流感毒株。

4 讨论

流感的MDCK细胞分离培养与鉴定是当今流感诊断和流行判断最可靠的一种方法[2]，此外流感病毒PCR核酸检测也有重要的意义，它能够快速、准确地诊断出阳性毒株，并且进行准确的分型，同时对MDCK细胞分离培养有重要的参考意义[3]。关于PCR检测中的Ct值对MDCK细胞分离培养有哪些参考价值也值得深入探讨，包括Ct值的高低对阳性检出率的影响等。

MDCK细胞分离培养增毒过程中，还有很多因素可以影响病毒的增殖，如选择细胞的代数、状态、疏密程度及操作者的操作手法等，这就要求实验人员有较丰富的经验和熟练的操作手法，还要有严格的无菌操作过程以避免实验过程中造成污染[4]。

流感病毒的组织培养工作最主要的目的是获得流感毒株并且进行流感毒株的分型[5]，这样可以方便我们掌握好每一个流感流行季节的流感动态趋势。通过我们的工作可以清楚地知道每年流行哪一个类型的流感病毒，也能够及时发现每个年度出现的新变异株，尤其是大流行株。流感病毒具有极强的变异性，抗原漂移和抗原转变使它经常出现新的变异毒株，造成全球大面积地区的流行，因此流感疫苗也需要年年接种，而不能达到一针见效或者是终身免疫的效果，也正因为流感超强的变异性给流感疫苗的研发制作带来了很大的难度。流感疫苗制备必须一直要根据监测的流感流行动态来进行不断的调整和更新。工作中，一旦发现流感的新变异株时，就需要立刻引起高度重视，及时将培养出的新变异株上送至国家基本预防控制中心，这样才能保证及时调整疫苗的生产制作，也只有不断调整疫苗的生产制作才能够针对流感病毒的变异性发挥出最大的作用，最大限度地提高人体对流感病毒的免疫力，降低流感病毒的死亡率。

关于流感病毒的分离培养还有很多问题需要进一步探讨和研究，比如流感不同型别的毒株分离培养的特点等，希望能够不断探讨，不断提高流感检测技能，也希望能够利用不断完善的理论知识去指导实践工作，让流感病毒组织培养工作实现更大的社会价值。