冷冻精液输精深度和时间对蒙古羊受胎率的影响

赵 霞，马跃军，刘 斌，吴铁成，高玉林，李玉荣，乌兰其其格，苏雅拉图，乌仁图亚

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.锡林郭勒职业学院，内蒙古 锡林浩特 026000；3.赤峰市巴林左旗乌兰达坝苏木动物防疫站，内蒙古 巴林左旗 025463；4.赤峰市巴林左旗畜牧工作站，内蒙古 巴林左旗

025450）

利用冷冻精液对家畜进行人工授精时， 由于输精方法不同，受胎率存在显著差异。特别是对绵羊、山羊进行人工输精时，情期受胎率低的问题仍然没有得到有效解决。 母羊子宫颈结构特殊［1-2］以及缺乏有效的人工授精方法是造成受胎率低的主要原因。母羊子宫颈内输精越深，到达受精位点的精子数量越多，受精率和受胎率越高［3］。 腹腔镜辅助子宫内输精是20 世纪80 年代应用于绵羊的一种有效人工繁殖技术， 是利用冷冻精液进行人工输精的首选技术之一［4］。 使用常规输精方法时，利用冷冻保存的公羊精液对母羊进行人工授精，母羊受胎率往往较低， 主要原因是操作人员对输精深度和时间把握不准确。为此，笔者以蒙古羊为研究对象，通过比较冷冻精液不同人工授精方法（常规输精法、 过子宫颈输精法以及腹腔镜辅助子宫内输精法）对母羊受胎率的影响，确定最佳输精深度和时间， 为提高母羊冷冻精液人工授精受胎率提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物选择及饲养管理

1.1.1 采精种公羊的选择及饲养管理选择3～5岁、体况健康的种公羊进行精液采集。 种公羊入选标准为生殖系统发育正常，两侧睾丸匀称，性欲旺盛，精液品质良好。 于采精前30～40 d 饲喂种公羊配种期专用日粮，期间逐渐增加专用日粮的比例，直至完全替换。种公羊每天保持2 km 以上的运动距离，使其保持旺盛的新陈代谢和性欲机能，以生产品质良好的精液。 试验期间种公羊每天采精1～2 次。

1.1.2 受体母羊的选择及饲养管理选择健康无病、发育良好、具有正常繁殖能力、膘情中等以上的蒙古羊母羊作为受体。 配种前30～40 d 根据母羊体况进行分群饲养，给予适当的短期优饲，增加优质干草和混合精料的饲喂量，以增强母羊体质。

1.2 试验药品、试剂及器材

葡萄糖、柠檬酸钠、三羟基氨基甲烷（Tris）、青霉素、链霉素、双蒸水、甘油、国产孕酮海绵栓、孕马血清促性腺激素（PMSG）、静松灵、苏醒灵、酒精、碘酒等。 羊用胚胎移植手术架（自制）、过颈输精器（自制）、子宫角输精器、腹腔镜、持针器、手术刀、手术用剪刀、外科缝合针及线、注射器、碘酒、酒精、新洁尔灭等。

1.3 冷冻精液来源

吸管冷冻精液，每支精液量0.5 mL，含有效精子数7 000 万个，活率0.35 以上。 输精前抽检20支吸管精液，对精子活力、呈直线前进运动精子数量、存活时间、畸形率、顶体完整率、细菌菌落数、病原生物等指标进行检验，均符合标准。

1.4 受体母羊分组及冷冻精液输精方法

经同期发情处理的受体母羊， 在发情后不同时间使用3 种方法进行冷冻精液输精： 常规输精法、过子宫颈输精法、腹腔镜辅助子宫内输精法，过子宫颈输精法包括过子宫颈第一皱褶（1～2 cm）输精和过子宫颈第二到第三皱褶（3～4 cm）输精。每种输精方法分3 组，不同输精方法的输精时间、分组情况及受体母羊数见表1。

表1 不同输精方法受体母羊分组及数量 单位：只

1.4.1 常规输精法受体母羊统一采用孕酮海绵栓进行同期发情处理。 在埋置孕酮海绵栓后的第14 天撤栓，同时肌肉注射PMSG 250 IU/只。 对通过试情挑选出的稳定接受公羊爬跨的受体母羊进行2 次输精，母羊发情后约14 h 和22 h 各输精1次。 第1 次输精时， 上午发情的母羊下午输精1次，下午发情的母羊隔日上午输精1 次。第2 次输精时（第1 次输精后约8 h）严格检查母羊阴道黏液变化， 当黏液稠而略带黄色、 不结块时进行输精。 将开膣器插入阴道，找到子宫颈口进行输精。

1.4.2 过子宫颈输精法发情后的母羊术前空腹12 h 以上，只饮水不喂饲草料。手术时将母羊保定在特制的手术架上，使其呈仰卧姿势，抬高母羊后躯，使外阴与地面呈80°～90°角。 在母羊发情后约14 h 和22 h 各输精1 次。 借助特制的带有光源的开膣器固定子宫颈口，用特制的输精针（17G）轻轻扎入子宫颈，并操纵输精针通过子宫颈皱褶，将冷冻精液送到合适位置，并记录输精深度。

1.4.3 腹腔镜辅助子宫内输精法发情后的母羊术前空腹12 h 以上， 在母羊发情后30～36 h 输精1 次。 借助腹腔内窥镜，采用套管针穿刺方法，将冷冻精液直接输入发情母羊子宫角。

1.5 输精后母羊的饲养管理及受胎率计算

输精后的母羊每天补饲优质干草、青干草、青贮饲料，妊娠后期适量补充精饲料、微量元素等。输精后40 d 用B 超仪检测母羊妊娠情况，计算受体母羊受胎率。

1.6 数据分析

采用单因素方差分析法 （One-Way ANOVA）对接受不同输精方法处理的受体母羊受胎率进行方差分析， 应用Etukey-Kramer 检验评估统计学差异，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

由表2 可知， 腹腔镜辅助子宫内输精法的受体母羊受胎率平均值最高，为60.2%；其次为过子宫颈第二到第三皱褶（3～4 cm）输精，受体母羊受胎率平均值为58.3%；过子宫颈第一皱褶（1～2 cm）输精和常规输精法的受体母羊受胎率平均值相近，分别为37.5%和36.3%。

表2 不同输精深度和时间对受体母羊冷冻精液受胎率的影响 单位：%

统计学分析结果表明， 腹腔镜辅助子宫内输精法和过子宫颈第二到第三皱褶（3～4 cm）输精的受体母羊受胎率平均值显著（P<0.05）高于常规输精法和过子宫颈第一皱褶（1～2 cm）输精；过子宫颈第二到第三皱褶（3～4 cm）输精的受体母羊受胎率平均值与腹腔镜辅助子宫内输精法差异不显著（P>0.05）， 常规输精法的受体母羊受胎率平均值与过子宫颈第一皱褶 （1～2 cm） 输精差异不显著（P>0.05）。

3 讨论

3.1 冷冻精液品质对母羊受胎率的影响

当前， 羊精液冷冻保存技术的成熟度与牛精液相比还有很大差距， 羊冷冻精液解冻后的精子存活率不稳定，一般不超过50%［5］，这是导致使用冷冻精液对母羊进行人工授精受胎率不高的原因之一。 羊冷冻精液保存过程中的关键问题是减少降温过程对精子造成的损伤。 不同动物精子对降温的敏感程度不同， 而羊精子对低温环境更加敏感。目前，虽然卵黄等保护性物质已经广泛应用于羊冷冻精液的保存技术研究［6］，但在实际生产中还存在很大程度的局限性。因此，应寻求更好的保护剂提高羊精液在冷冻保存过程中的精子存活率，以提高母羊人工授精受胎率。

3.2 输精时间和次数对母羊受胎率的影响

动物排卵行为发生在发情期结束前后，因此，人工授精应在排卵前进行，以便排卵时在受精部位壶腹部聚集大量精子。一般情况下，对母畜每天早晚各试情1 次，上午发情的动物应在晚上（发情后10～12 h）进行授精，晚上发情的动物应在次日上午（发情后14 h）进行授精。 2 次授精可有效保障受体母畜受胎率。 授精时间应根据使用的是新鲜精液还是冷冻精液输精进行调整。对羊来说，利用新鲜精液输精时， 精液在母羊生殖道内沉积时间最好不超过24 h，而利用冷冻精液输精时，精液在母羊生殖道内的存留时间不应超过12 h。 由于冷冻后再解冻的精子寿命较短， 所以当母羊排卵时，2 次（间隔8～10 h 输精1 次）输精可能会在受精部位提供大量的活精子，有利于提高受胎率。

3.3 母羊子宫解剖结构和输精深度对受胎率的影响

母羊子宫颈结构特殊，与括约肌类似，向后突入阴道，具有很厚的壁和一条狭窄的管腔。反刍动物子宫颈的凸起结构形成横的或螺旋形的嵴，进而形成轮状环，互相契合将子宫颈严密封锁。这些轮状环结构是导致母羊受胎率低的主要原因之一［1-2，7-8］。 在子宫颈不完全穿通时，部分或全部精液会回流到阴道内， 而阴道内的酸碱度对精子存活不利；在子宫颈中段穿刺术中，精子几乎都在子宫颈环部位，无法进入子宫，这是常规输精和过子宫颈第一皱褶输精受胎率低的原因。 在完全穿刺子宫颈手术中，精液直接进入子宫，离受精位点非常近，有利于受孕［9-10］。 但子宫颈管穿透深度受子宫颈管解剖结构的影响。 子宫颈内腔皱褶少或无皱褶的子宫颈具有较好的收缩性，较容易通过。子宫颈口到子宫颈前两个皱褶被证明是限制子宫颈穿透性的主要因素。

过子宫颈输精是将输精枪头插入子宫颈口进行人工授精的一种方法［4］。 不同动物子宫颈管长度、弯曲度和可穿透性差异较大，品种、年龄、产羔史等因素可影响输精器的穿透深度［11］。 该研究结果表明，采用过子宫颈输精法对受体母羊输精，当授精深度接近4 cm 时才能达到与腹腔镜辅助子宫内输精法接近的受胎率， 同时获得比常规输精法更高的受胎率。

腹腔镜辅助人工输精虽然已成为一种有效的人工授精方法，但其实际上是一种微创手术。在操作过程中，母羊在手术架上停留的时间较长，当进行大规模腹腔镜辅助人工授精时， 存在耗时、耗力、影响母羊受胎率的问题。该技术用到的腹腔内窥镜成本较高， 其设备和劳动力投入比过子宫颈输精法更大， 同时要求技术人员具有较高的操作水平和熟练程度。 这些因素限制了腹腔镜辅助人工输精技术在生产中的大范围推广。此外，从保障动物福利的角度考虑， 应尽可能减少创伤性人工授精对母羊机体健康产生的负面影响。因此，研发更加便捷、 高效的非创伤性输精方法是未来羊人工授精技术发展的方向。