β细胞替代治疗1型糖尿病的研究进展

杨静静，戎成振，蒋 影，曹秀菁

(1.阜阳市第二人民医院 a.内分泌科；b.心内科；c.检验科, 安徽 阜阳 236000；2.安徽医科大学，安徽 合肥 230032)

1型糖尿病患者治疗的主要目标是使其血糖保持在最佳的范围，避免严重低血糖、酮症发生，延缓糖尿病慢性并发症的发生。很多患者通过强化胰岛素治疗可达到这一目标，但对于病程长、肾功能下降的患者却经常发生胰岛素治疗后的低血糖事件。β细胞替代治疗可通过恢复胰岛素水平，以及调整影响血糖的相关激素，调节胰岛素分泌来维持血糖水平的正常波动。诊断排除糖尿病的供体，其提供的胰腺细胞进行移植可明显改善1型糖尿病患者血糖波动。移植后通过免疫抑制来预防自身免疫和同种免疫反应，通常会使血糖持续维持在正常水平。胰腺移植有巨大的手术并发症风险，其中大部分与胰腺的外分泌组织有关。1999年, 在加拿大的埃德蒙顿, Shirpiro等将分离、纯化后的胰岛移植给7例糖尿病患者, 2003年末, 由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health, NIH)免疫耐受网牵头的多中心临床研究显示, 在给予30例1型糖尿病患者54次胰岛输注后, 其中有随访资料的17例患者平均糖化血红蛋白A1c(hemoglobin A1c, HbA1c)为6.1%, 均无需胰岛素治疗, 其中4例患者不依赖胰岛素治疗达2年余。2005年1月20日报道日本京都大学医院19日成功完成了世界首例活体胰岛细胞移植手术。接受移植的是1例20岁左右的女性糖尿病重症患者，移植用的胰岛细胞来自她的母亲。中国胰岛移植研究方兴未艾，海军军医大学附属长征医院完成胰岛移植的数量及疗效位居国内第一。此外，长征医院与上海仁济医院、瑞金医院合作开展了6例胰岛移植；深圳、青岛、安徽等地的胰岛移植手术也已经陆续开展。天津市第一中心医院成功完成全国首例小儿胰岛移植。供体器官短缺是全世界移植领域的共同难题, 它同样也严重制约了胰岛移植的开展。随着分离技术不断改进, Edmonton方案推广以来, 从一个移植受者需接受2～3个供体的胰腺, 到目前使用单个胰腺已能成功移植。

胰岛移植的侵入性较小，其替代胰岛素治疗1型糖尿病的潜力也得到了充分证明，Shapiro等[1]研究结果表明，胰岛移植可以使患者胰岛素更好发挥作用，具有良好的代谢控制作用，对于患严重的低血糖或血糖控制不佳引起的意识障碍的1型糖尿病患者，胰岛移植是有效的治疗方法之一，对于低血糖引起的意识障碍有很好的预防作用[2]，一项随机临床试验也证实了胰岛移植相比于单用胰岛素治疗，对严重的1型糖尿病患者起有效的干预作用[3]，1型糖尿病患者经常发生严重的低血糖时，启用肝内胰岛移植可长期有效改善血糖控制水平和低血糖症状，有助于血糖的稳定[4]。胰岛移植治疗晚期1型糖尿病疗效确切，创伤小、安全性高[5]，可改善糖尿病患者周围感觉神经的传导速度[6]。在血糖波动较大的严重低血糖患者中，胰岛移植后血糖得到了更好的控制，对患者是否发生慢性并发症及生存时间产生更大的影响[7]，降低了低血糖频率和血糖变异性。本文旨在介绍β细胞替代治疗1型糖尿病的方法、β细胞替代的来源以及如何解决和避免潜在的移植后免疫抑制。

1 β细胞替代：胰岛分离及胰岛移植

β细胞替代最主要的一种方法就是同种异体胰岛移植，旨在通过将胰岛植入到胰岛素缺乏型糖尿病患者体内，以补充胰岛素缺乏糖尿病患者体内适当的胰岛素、胰高血糖素等，这种情况最常见于1型糖尿病患者。胰岛移植通过匿名多器官捐赠获得的胰岛与已故捐赠者的胰腺分离。在极少数情况下，部分胰腺切除术会从一个活体的相关供体中分离出胰岛，约43%的最初身体健康的捐赠者在部分胰腺切除术后会出现葡萄糖耐受不良[8]，由于手术和代谢风险较高，因此通常不使用该技术。胰岛移植根据标准化技术，基于酶和机械消化法分离胰岛，然后进行密度梯度纯化[9]，如果获得的胰岛数量超过20万，则通常将其释放出来进行移植，并对胰岛活力、纯度、组织体积和无菌性进行可行性的评估。胰岛移植制备过程中，需要提高移植胰岛的纯度，降低移植胰岛的组织量[10]。胰岛隔离技术是由很少机构(主要在北美，欧洲和澳大利亚)进行的，考虑到胰岛隔离小组有必要 24小时提供服务以及移植涉及复杂的协调工作，相关协调工作需要高度专业化的配套设施。胰腺的采购和运输应尽量减少冷缺血时间，胰岛设施可以将胰岛运送到区域中心进行移植。

从已故的供者胰腺中分离出胰岛，在通过微创切开或经皮肝穿刺门静脉插管，然后通过1型糖尿病患者门静脉注入分离的胰岛以输送至肝脏[11]，常规抗凝预防血栓，可能需要输注2～3个胰岛制剂(胰岛素目标是受体体重至少9 000 U/kg)，尽管一些中心报告说，当从单个供体胰腺移植胰岛时，获得胰岛素独立性的患者比例很高，至少要移植胰岛6 000 U/kg。胰岛移植需要国家监管机构，器官采购组织，组织分型实验室，胰岛分离设施以及移植手术，内分泌科和放射介入科之间密切合作。

随着全球应用干细胞治疗疾病已经积累了大量成功有效案例，干细胞也成为了继手术和药物之后，新的糖尿病治疗方向。胰岛内灌注干细胞治疗，结果导致糖尿病患者代谢控制增强，胰岛素需求减少[12]。亦有研究表明：干细胞治疗治疗与Th1、Th17细胞的增殖和功能下降有关，效果优于传统的胰岛素强化治疗[13]。目前为止，在世界范围内间充质干细胞治疗糖尿病的临床案例确实已经有了数千例，而这些公开的案例表明干细胞治疗糖尿病这一疗法确实能够使糖尿病患者的病情得到一定程度上的逆转，同时对胰岛素的依赖也是大大的降低。经后期随访，采用了干细胞疗法的糖尿病患者，胰岛功能有了明显的恢复，对胰岛素的依赖大幅度降低，且能很好地控制体内的血糖。在长期随访中发现，接受干细胞疗法的糖尿病患者最长能够连续3年不再依赖胰岛素。并且在临床上这一疗法没有任何不良反应。相信干细胞治疗糖尿病及其并发症的实现转化应用不会太遥远。

2 β细胞替代治疗后的免疫抑制

免疫抑制包括在每次输注胰岛时的诱导阶段，然后是在胰岛移植整个生命周期中的维持阶段，通常不使用糖皮质激素。胰岛移植的第一个临床上成功的方案，即所谓的埃德蒙顿方案，包括在每次输注胰岛之前联合应用抗白细胞介素 2(IL-2)受体抗体(一种T细胞激活抑制剂)、西罗莫司(一种mTOR抑制剂)和小剂量他克莫司(一种钙调神经磷酸酶抑制剂)[1]。 自2000年首次应用以来，该方案的衍生方案相继发布。这些方案的变体包括使用不同的诱导剂，例如T细胞耗竭剂(抗淋巴细胞免疫球蛋白，阿伦单抗、抗-CD3单克隆抗体teplizumab)或淋巴细胞追踪抑制剂(依法利珠单抗)[14-15], 以及使用其他维持治疗组合方案：抗胸腺球蛋白联合阿那白滞素抗炎药诱导，以及他克莫司联合霉酚酸酯维持治疗(T细胞耗竭伴抗炎方案：TCD-AI)[16]。

3 β细胞替代治疗移植监测

移植监测的目的是使用最小限度的免疫抑制药物，监测移植排斥反应和自身免疫的复发，筛查与糖尿病或免疫抑制有关的并发症，尤其是机会性感染和肿瘤形成，并评估胰岛移植恢复代谢平衡的有效性。始终如一的移植后监测是必不可少的，早期每周1次，以后每月1次，随后定期探访或与患者预约门诊监测，与胰腺移植相比，胰岛无法进行活检。因此，胰岛排斥反应主要通过降低C肽浓度来表示，这与代谢控制的恶化有关。尽管已经尝试了类固醇和利妥昔单抗的治疗，但急性排斥反应的治疗仍然困难。利用多功能液相芯片分析系统技术密切监测胰岛移植患者的循环人类白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA)抗体，可以及时发现和有效治疗胰岛移植排斥反应。监测细胞免疫反应性可用于确定影响移植物存活的因素，并评估免疫抑制的有效性[17]。移植胰岛组织外体平台可作为监测胰岛细胞移植患者临床标准的辅助手段，可为胰岛损伤的早期诊断提供帮助，并有助于区分损伤类型(复发性自身免疫或免疫排斥反应)，从而为治疗干预提供了一个更早的窗口。

4 β细胞替代治疗局限性和未来的方向

4.1替代胰岛来源 尽管β细胞替代治疗-同种异体胰岛移植是公认的替代方法，但由于胰岛分离的供者胰腺的可用性以及区域分离设施对移植计划的可及性，限制了胰岛移植的发展。胰岛来源的发展使按需、无限量生产细胞产品成为可能，这将极大地扩展获得β细胞替代疗法的机会。尽管如此，这种胰岛来源仍必须克服重要的安全问题和生产效率低下的问题。

猪胰岛是可移植的胰岛中的异种来源，并且在生理上保持与人类相似度。但是，异种组织的移植比同种异体组织的移植具有更大的免疫学障碍，存在超急性排斥反应的风险，需要加强免疫抑制。异种移植还引入了传播人畜共患病感染(如猪内源性逆转录病毒)的隐患。新的基因组编辑方法正在尝试改造具有比目前更低的免疫原性和逆转录病毒负担的猪胰岛，以增强该细胞来源的潜在功效和安全性。人类干细胞分化为产生胰岛素的胰岛，为胰岛移植提供了另一个潜在的细胞来源，人胚胎干细胞可以在体外分化为胰腺内胚层祖细胞。在小鼠模型中移植后，胚胎干细胞进一步分化为胰腺内胚层祖细胞阶段，体内分化为胰岛组织及β细胞[18]。联合移植的脂肪间充质干细胞具有改善胰岛移植物功能, 延长移植物存活时间及促进移植物血管再生的作用[19]，从干细胞中获得的胰岛也已经从1型糖尿病患者中分化出来，使用可诱导的多潜能干细胞诱导产生β细胞[20]和体细胞核移植[21]，这可能会消除同种免疫。然而，自身免疫性复发是任何人类组织来源所面临的障碍。

4.2替代植入部位 肝是同种异体胰岛移植已建立的最有效的胰岛植入部位，并且该部位在临床大动物模型的猪胰岛移植中非常成功。对于这种成熟的胰岛细胞产品，不需要用于监视细胞身份的通道，1型糖尿病患者将胰岛成功植入肝外的唯一案例是使用生物人工凝血酶支架制成的网膜袋，这对于门静脉内胰岛输送禁忌证的患者可能有用。然而，大网膜的位置并不比肝脏更容易进入，而肝脏对于活检监测或提取可能需要干细胞来源的胰岛。利用前臂肱二头肌进行肌内移植的病例显示自体胰岛的存活率。 动物实验结果显示：胰岛移植的部位可选择肠系膜下、肾被膜下[22-23]、以及胃浆膜下层[24]，骨髓移植[25]。为更有效的治疗，需要发明出能够抑制缺氧导致的胰岛细胞死亡并促进快速血运重建的生物支架。

4.3免疫抑制的替代方法 慢性免疫抑制的限制了目前胰岛移植的适应证，主要是患有严重低血糖事件并伴有低血糖意识障碍的患者，在1型糖尿病患者中此类患者占比不到10%。胸腺球蛋白诱导的免疫抑制方案、以及钙调神经磷酸酶抑制剂/类固醇保留胰岛方案导致长期胰岛素独立，这种新的免疫抑制方案是有效的，且耐受性好，可能是改善移植胰岛功能和寿命的有效替代方案，同时最小化肾细胞毒性[26]。胰岛素的独立性的长期维持仅需很少的免疫抑制药物，在此种情况下，没有维持免疫抑制的药物可支持实现对胰岛移植的耐受性。

持续建立对同种抗原和自身抗原的免疫耐受诱导，以用于治疗1型糖尿病的细胞疗法，在此之前，一直用封装设备进行胰岛细胞产物的免疫分离。源自人类胚胎干细胞的胰腺内胚层细胞，皮下放置在1型糖尿病患者的细胞不可渗透装置中，表明这些细胞的存活由于纤维化异物反应而大大降低，通过大囊化免疫隔离具有在设备中装有可再填充的氧气室后，才能维持1型糖尿病患者的胰岛生存。有研究报道：在无任何免疫抑制的情况下，用生物人工胰腺装置在糖尿病灵长类动物中成功和安全地移植猪胰岛[27]。动物实验表明，γδT细胞在胰岛移植后保持移植胰岛的存活，维持血糖稳定起到重要作用，给胰岛移植后免疫诱导免疫耐受奠定基础[28]。

β细胞替代治疗1型糖尿病已经证明长期有效，胰岛移植作为β细胞替代治疗1型糖尿病主要方法之一，既可以减轻1型糖尿病患者不稳定的糖尿病的血糖负担，又可以预防长期的糖尿病相关并发症的发生。对于患有严重低血糖事件并发低血糖意识障碍的1型糖尿病患者，同种异体胰岛移植是一种安全的治疗选择。胰岛移植的途径受到胰腺细胞供者的数量、胰岛分离的可用性和免疫抑制的限制。β细胞替代治疗1型糖尿病的未来的方法可能包括胰岛的替代来源，肝外植入部位以及诱导免疫耐受或免疫隔离，但这些方法仍需要更高级别的临床试验得以证实。