多孔钽 - 细胞 - 骨界面作用的研究进展

陈凯 宋会平

医用金属材料在临床骨科、牙科等领域应用广泛，作为一种生物替代材料，修复、提升、重建或替代机体原有组织结构是此类材料被探索和开发的潜能所在[1]。当前临床应用较多的医用金属材料主要有钛及钛合金、钴铬合金和不锈钢等[2]，类似于人体松质骨结构[2-3]的多孔钽作为一种有前途的生物材料[4-6]，在促进各类骨细胞增殖、分化形成成熟组织等方面均表现出优于其它现有金属植入材料的生物相容性[4]，除了在髋关节置换和翻修的临床应用中发挥了优良的骨长入和稳定性，在膝关节[7]、踝关节[8]以及脊柱[9]损伤的修复中同样展现了良好的骨整合能力，但是钽 - 细胞 - 骨界面整合有限、制作工艺难、成本高阻碍了多孔钽作为植入材料在临床骨缺损、骨重建与修复以及骨替代等治疗方面的推广，笔者主要就多孔钽与各种骨细胞作用、多孔钽骨整合界面特性作简要讨论。

一、多孔钽与骨髓基质干细胞 ( bone marrow stromal stem cells，BMSCs )

1. 多孔钽 - 细胞复合物诱导骨分化：BMSCs 在体内结合可改善成骨，促进骨形成和骨骼发育[3]。BMSCs 在生物材料的骨再生和骨整合过程中起着至关重要的作用[10-11]，具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜力[12]且相对容易被分离出来用于其它研究，为骨组织工程提供了良好的骨祖细胞来源[13-14]。在体外和体内实验方面，Wei 等[3]和 Wang 等[15]采用了化学气相沉积法制备了网状玻璃碳多孔钽并评估了钽的生物活性：与对照组相比，前者实验中所用的 BMSCs 和后者的成骨细胞增殖均没有受到抑制，直接表明多孔钽对细胞增殖无明显毒性[16]；同时，Wei 团队将带有 BMSCs 的多孔钽分别在体外培养和植入犬体内并对细胞的黏附、增殖、扩散及形态观察发现，随着时间延长，与无钽对照组相比，无论是在体内还是体外，多孔钽 - BMSCs 复合材料均表现出优异的促进细胞黏附和扩散的能力，细胞由最初的纺锤形逐渐增殖分化为多种形状且相互连接，促进了 BMSCs 向成骨细胞方向分化，形成新生骨小梁。在临床应用中，Zhao 等[17]使用多孔钽 - BMSCs - 血管化骨复合移植物对人股骨头坏死 Ⅲc 期和 Ⅳ 期患者进行临床治疗并长期随访，与单血管化骨移植相比，无论是术后 5 年移植成功率还是代表治疗效果与预后的平均 Harris 髋关节得分 [ 从 ( 38.74±5.88 ) 分提高至 ( 77.23±14.75 ) 分 ] 均显著提高；这一指标在 Ⅰ 期和 Ⅱ 期手术时则由 62 分显著提高至 92 分[18]。多孔钽 - BMSCs 界面骨整合有利于延迟或避免晚期股骨头坏死的全髋关节置换。

2. 多孔钽激活分子信号通路增强骨诱导：作为极具分化潜力的干细胞，BMSCs 成骨化的过程受到多种信号通路和调节因子的影响，BMP2 / Smads 途径、MAPK / ERK 信号通路等参与其中。骨形态发生蛋白 2 ( BMP2 ) 参与 BMSCs 成骨化诱导，小母体 - 十五倍体同源物 ( small mothers against deca-pentaplegic homologs，Smads ) 激活介导 BMP2 信号以促进 BMSCs 的成骨化[19]。Lu 等[20]解释了骨质疏松模型下钽 - BMSCs 复合材料激活 BMP2 / Smad1 信号传导以诱导成骨分化的过程，与钛组相比，钽组的矿化水平、BMP2、Smad1、RUNX2 和碱性磷酸酶 ( ALP ) 表达水平均占有明显的优势 ( 约为钛的 1.2～1.8 倍 )；反之，在使用 BMP2 或 Smad1 抑制剂后，RUNX2 和 ALP 表达水平则大大降低 ( 下降 50%～70% )；也就是说，在这一过程中，钽首先激活了 BMP2 / Smads 的信号传导，BMP2 水平的提高、Smad1 的磷酸化表达诱导 RUNX2 和 ALP 水平的显著增高，表明 BMSCs 向成骨方向分化，这一过程还可能因为钽表面 BMP2 本身的自我诱导能力而被放大，进一步增强钽的骨诱导能力。

丝裂原激活的蛋白激酶 ( MAPK ) 家族是调节 BMSCs 成骨化的潜在机制，其中 MAPK / ERK ( mitogen-activated protein kinase / extra-cellular signal-regulated kinase ) 信号通路的激活或抑制直接影响了 BMSCs 的分化与否[21]。Dou 等[22]的研究发现促进 BMSCs 成骨化的过程与多孔钽激活 MAPK / ERK 信号通路有关，制备出完全相同孔径、孔隙率和形状的多孔钽和多孔钛两种材料，使用大鼠第三代 BMSCs 进行体外实验：在细胞的黏附、增殖测定以及成骨基因表达水平测定中，钽均表现出显著高于钛的成骨分化；关键指标 p-ERK ( MAPK / ERK 信号通路的效应蛋白 ) 测定同样显示钽组优于钛组；选择性抑制 MAPK / ERK 信号传导途径的 p-ERK 水平，进一步表明钽通过激活 MAPK / ERK 信号通路，增加其效应蛋白 p-ERK 的表达并促进了 ALP 及其它成骨基因的表达，进而诱导 BMSCs 的体外成骨化。

二、多孔钽与成骨细胞

1. 多孔钽契合骨生理并促进骨分化：在成骨细胞分化成熟的过程中，ALP、Ⅰ 型胶原蛋白 ( COL-1 )、骨唾液蛋白 ( BSP-1 )、骨钙素 ( OCN ) 等细胞基质以及钙含量的测定具有重要意义。ALP、COL-1 被看做是早期分化标志物，OCN 和钙含量则被认为是晚期分化和矿化的标志物[22-23]。在 Sagomonyants 等[24]的研究中分别比较了 45 岁以下和 60 岁以上女性患者成骨细胞在多孔钽、钛网和塑料培养基上的黏附、增殖、分化及矿化情况发现：黏附在钽上的细胞数量明显多于钛网和塑料培养基 ( 多 25%～30% )； 对年轻和老年患者的细胞增殖测定显示钽组分别比钛网组增长 3.7 和 5.9 倍，比塑料组分别提高 11.6 和 16.4 倍；在细胞分化的初始阶段，ALP 在 90% 以上的成骨细胞中表达，而到了 3 周时，钽基上 ALP 的表达水平最低，COL-1、OCN 和钙含量则最高，表明多孔钽促进成骨细胞依序由早期分化进入高度分化、趋于成熟的矿化阶段；Welldon 等[25]通过测定单克隆抗体 STRO-1 和抗碱性磷酸酶染色细胞 ( AP ) 以表征成骨细胞的分化程度，分化顺序依次由 AP-STRO1+，AP+STRO1+，AP+STRO1-和 AP-STRO1-细胞[26]4 个亚群表征，在 2 周时 ( 分化中晚期 ) 多孔钽上 ALP 高表达和 STRO-1 低表达 ( 即高度分化的 AP-STRO1-阶段 )、BSP-1 和 COL-1 持续低表达。作为早期分化标志的 COL-1、BSP-1 随分化的进行逐渐下调，AP-STRO1-的高表达表明进入到中晚期高度分化的阶段，Sagomonyants 和 Welldon 的实验证明了钽 - 细胞界面作用遵循成骨基因表达顺序，这种高度契合骨形成生理过程特性为它发挥良好的促细胞成熟提供了条件，而早期分化标志物 ALP 在分化中晚期依然表现出较高的水平，除了观察时间的选择不同，可能与多孔钽的“延迟成熟”有关。

2. 多孔钽延迟成熟作用：成骨细胞的成熟部分受经典 Wnt 信号通路的调节，此通路可致转录因子 RUNX2 的上调并促进成骨，Ninomiya 等[27]比较了成骨细胞在多孔钽、钛网和钴铬珠界面上的成熟度，早期 ( 4～7 天 ) 即在多孔钽表面和内部发现数量最多的成骨细胞，对 RUNX2 因子活化测定发现，钛与钴铬珠界面 RUNX2 的表达在 5～11 天时达到峰值，而多孔钽 RUNX2 的上调则延迟到 11 天时刚刚开始，致使骨基质 OCN 分泌和 ALP 活化同样延迟，OCN 和 ALP 低水平表达持续 3 周，而 3 周后对各组成骨细胞矿化水平的测试发现，钽组表现出最为显著的矿化增加，说明多孔钽在早期促使细胞内生长并布满钽表面后，才开始成骨细胞的分化成熟过程和新骨的形成，称之为“延迟成熟”，延迟后 ALP 中晚期表达水平增高，骨成熟和骨长入在 RUNX2 上调延迟的情况下更加充分完整。Wang 等[15]证实成骨过程在植入后的早期阶段 ( 1 周内 ) 仅发生在宿主骨的表面上，且骨的形成与长入是时间依赖性 ( 3 周左右 ) 的，钽 - 宿主骨界面处的新骨组织会随着时间的流逝而成熟，钙的沉积随后发生，在遵循了良好基因表达顺序的同时，通过“延迟成熟”机制促进成骨细胞的成熟和长入。

3. 多孔钽抑制 MAPK / p38 信号通路加强骨保护：ERK，p38 和 JNK 分子是 MAPK 家族的三大成员，在氧化应激条件下，MAPK / ERK 信号通路促进细胞有丝分裂与成骨细胞存活，MAPK / p38 信号通路导致成骨细胞功能障碍、细胞凋亡和线粒体死亡[28-29]。Wang 等[30]比较了糖尿病模型下绵羊体内多孔钽与钛对骨缺损修复及作用机制研究，结果发现钽组成骨细胞的数量、形态、ALP 活性及矿化水平均远高于钛组且极少出现细胞凋亡；钛组的 MAPK / p38 水平远高于钽组，MAPK / p38 过度磷酸化，导致细胞凋亡；在使用抑制剂抑制 MAPK / p38 的磷酸化后，钛组细胞活性与增殖分化能力均显著恢复到钽组水平，表明多孔钽自身即可抑制活性氧的产生与 MAPK / p38 的过度表达，加强成骨细胞保护。

在临床骨缺损患者中，合并有类似糖尿病等严重影响机体氧化代谢疾病的患者极为常见，多孔钽在发挥其自身抗氧化能力抑制 MAPK / p38 信号通路表达、加强骨保护的同时，又能激活 MAPK / ERK 信号通路，增强 BMSCs 成骨化，拓宽了多孔钽在临床使用的适应证与使用人群；诸如 BMP2、BMP7 等蛋白修饰下的多孔钽在基础实验中同样展现出远优于单纯钽的生物整合能力[31]，为临床骨缺损伴韧带、肌腱的修复方法提供了参考依据。

4. 多孔钽 - 骨界面锚定：多孔钽修复骨缺损的过程中，骨组织向内生长，一方面体现了钽周围骨组织生长修复的过程，另一方面，生长入孔的各种骨组织与周围的松质骨相互交错所带来的黏附力、把持力在一定程度上可以发挥金属螺钉的锚定作用，增加植入物的稳定性。Welldon 等[25]在动物模型中比较了多孔钽与固体钽或塑料上成骨细胞的长入情况发现，在第 3、14、21 天分别观察到成骨细胞长入孔内距离金属表面 52.8 μm、103.2 μm 和 189.6 μm 的位置；Fernández-Fairen 等[32]则在临床多孔钽全髋关节置换治疗中测量了该指标：在术后 6 周、6 个月及 20 个月测得骨组织长入的深度分别达钽孔内 0.68～1.14 mm、1.12～3.53 mm 和全孔 ( 5 mm ) 的位置，覆盖面积分别达钽孔的 ( 13.1±4.8 ) %、( 50.7±10.4 ) % 和 ( 76.0±10.9 ) % 的水平。随着制造工艺水平的提升，更高孔隙率、更复杂的多孔结构被开发出来，骨长入使得机械固定变为生物固定[6]。Wang 等[15]测试了多孔钽 - 细胞界面作用，他们使用的多孔钽材料表面具有均匀分布且相互连接、直径为 200～400 μm 的大孔，各大孔内部还具有粗糙的、直径更小的 ( 50～200 μm ) 微孔结构，这种高粗糙度的“孔中带孔”结构增加了细胞及骨组织接触面积，利于吸收更多的大分子，促进细胞黏附，增殖和成骨能力，增加稳定性。

为了持久地发挥钽良好的界面作用，维持钽骨界面稳定极其重要。由于长期存在于人体内，在负载磨损过程中，涂层或金属颗粒可能会从植入物表面释放出来并与局部细胞相互作用，导致复杂的局部细胞反应，进而可能影响骨形成与吸收之间的平衡[33-34]。多孔钽内部相通的孔隙结构为金属植入物脱落颗粒的迁移提供了通道，这意味着相当于异物的金属脱落颗粒不会长久的“定居”在金属植入物的周围，将减少炎症反应且可以避免植入物周围的骨溶解，Rahbek 等[35]通过对比聚乙烯颗粒 ( polyethylene，PE ) 在植入犬膝关节中的多孔钽与钛合金周围的迁移情况发现，钽孔内具有更多的骨髓和少量的纤维组织以及一定数量的 PE 颗粒，周围的 PE 颗粒则明显少于钛植入物；骨植入物界面处的振荡压力是影响骨组织、致骨细胞死亡、骨溶解的原因[36]，钽植入物的多孔结构诱导的异物颗粒内移、骨组织向内生长会产生一种力正好分担并减少了植入物表面压力，称之为“流体流动压力”效应，正是这一分担效应使得钽植入物表面压力不会升高到抑制骨形成或发生骨溶解的程度，从而发挥出比钛植入物更好的生物相容性。

Kang 等[37]在体外培养液中加入源自于多孔钽的纳米钽颗粒，模拟钽在体内长期植入后的磨损颗粒，分别加入自噬诱导剂和抑制剂，观察成骨细胞活力和自噬对细胞增殖的影响，结果发现纳米钽促进了成骨细胞的增殖；在使用纳米钽的基础上，加用自噬诱导剂会进一步加强本来已经增强的细胞增殖作用，自噬抑制剂则会抑制这种增殖作用，而单独使用自噬调节剂则不会对成骨细胞活性和增殖产生影响，说明钽可以促进成骨细胞增殖并诱导“自噬”，而“自噬”可加强这种增殖作用。

5. 多孔钽的骨整合与增值改建：骨植入物接触指数 ( BIC 指数 ) 是描述植入物骨整合的常用指标[38-39]。作为关节假体，多孔钽展现出较高的 BIC 指数，感染条件下，钽良好的促骨细胞增殖、促骨长入、促骨组织分化的骨整合能力仍能保持。Wahl 等[40]报道了 1 例肱骨骨折内固定术后合并感染并进行肩关节多孔钽假体置换术的修复情况，术后 3 年反复感染并伴瘘管形成，对回收的关节假体进行组织学研究发现，骨长入的 BIC 指数为 32.0%，骨组织向孔内生长和覆盖钽表面的范围分别占相对骨面积的 8.2% 和 11.9%；在光镜下看到钽表面和孔内有新骨和骨髓的形成，钽孔内有成骨细胞、多核巨细胞、新生血管以及纤维组织的广泛存在，钽所带来的骨组织修复已处于较为成熟阶段，虽然最终没有完成感染情况下肩关节的修复，多孔钽展现的骨整合作用却为植入物的开发和术后并发症的管理带来新的机遇。Borland 等[41]报道了多孔钽在髋臼骨缺损修复的临床疗效，使用多孔钽增强器、自体细碎骨移植技术和骨水泥固定器对髋臼进行复杂重建并随访 3～ 7 年，患者普遍表达了极高的满意度且影像学显示钽 - 髋臼组件倾斜度 ( ＜ 1° ) 、移位度 ( ＜ 5 mm ) 均正常范围内，这极大地改善了移植材料早期无菌性松动的问题。

多孔钽表面修饰的兴起是激发钽潜能的新手段，使多孔钽界面作用和骨整合能力大大提高[42]，不同的修饰手段使钽骨界面的微观结构发生改建，产生“界面机械负荷”的力学作用[43]，这种力学信号刺激细胞基质蛋白完成成骨过程。不同的修饰物、修饰方式为钽界面作用的研究提供了多种方向，甘洪全等[42]研究了不同浓度精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 ( Arg-Gly-Asp polypeptides，RGD ) 多肽修饰下的多孔钽 - 成骨细胞复合材料界面作用，RGD 是细胞膜整合素受体与细胞外配体结合的识别位点，可促进细胞间黏附，结果发现成骨细胞形态改变并紧密黏附、铺展、延伸至多孔钽内部孔中，OCN、纤维连接蛋白 ( fibronectin，FN ) 及丝状肌动蛋白 ( filamentous actin，F-actin ) 的表达均显著增高且以 F-actin 的表达最强。F-actin 主要介导骨生成及骨重建，RGD 修饰下的成骨细胞 - 钽界面产生力学负荷，促使 F-actin 的重组与表达，使细胞骨架发生改变及重组以调控成骨基因的表达，加快骨基质矿化速度，细胞增殖、代谢加速及 Ⅰ 型胶原表达增强[43-44]。与细胞黏附率、基质蛋白表达水平均显著较低的未经 RGD 修饰的对照组比较，RGD 修饰的多孔钽 - 细胞界面表现出更好的骨整合能力。

作为颇具潜力的生物植入材料，多孔钽所具备的优秀的骨整合能力和界面特性越来越令人瞩目。目前，多孔钽已经在口腔颌面外科、骨外科、血管外科等临床中投入使用，形成多种形态、不同功用产品系列，用于缺损重建、假体涂层或支架。但是由于价格昂贵、加工工艺复杂，其临床使用率较低，与其优秀的生物学性能不相匹配。如何进一步提升钽生物学性能，提高钽 - 细胞 - 骨界面整合效率，促进钽材料的增值利用，已经成为目前医学融合研究的热点和重点课题之一。