眼部抑制性免疫微环境与调节T细胞杨璐菲

陈养浩 龚学春 武志峰

眼睛和免疫系统通过调节先天性及适应性免疫反应来维持眼部免疫特权，在发生眼内炎症时，眼部免疫特权能以最大程度降低视力损害的风险[1]。免疫特权最初在20世纪40年代被定义，Peter Medawar等发现植入前房内的同种异体皮肤移植片可以无限期存活，而在其他组织中则会被快速排斥[2]。一方面由角膜以及紧密连接的视网膜色素上皮细胞和视网膜毛细血管内皮细胞构成血-眼屏障，以形成封闭的眼内环境抑制炎症激活和控制免疫细胞功能[2]。另一方面，眼部观察不到直接的淋巴管引流，即同种抗原不能到达局部淋巴结并引发免疫反应，但并不代表眼内微环境中没有免疫细胞及免疫反应。一些眼内驻留细胞可以通过产生可溶性或膜结合分子来诱导调节T细胞(T-regulatory cells，Tregs)，促进免疫抑制性眼内微环境的发展和维持[3]。本文就眼内微环境中的免疫调节剂及调节T细胞在眼部免疫特权中的作用进行综述，以更好了解眼内免疫特权维护机制，为眼部炎症相关疾病的诊疗提供思路。

一、ACAID及调节T细胞

接种到前房的抗原被抗原呈递细胞捕获后通过血液携带至脾脏，还能运输至区域淋巴结或胸腺，带有眼源抗原的抗原呈递细胞(antigen-presenting cells, APC)在这些淋巴器官中诱导Tregs，从而抑制T细胞活化和分化为Th1效应细胞，并抑制Th1介导的免疫反应[4,5]。这种前房引入抗原后诱导外周抗原特异性免疫调节机制称为前房相关免疫偏差(anterior chamber-associated immune deviation, ACAID)，而相关研究显示玻璃体腔或后房也具有诱导全身免疫偏差的能力，称为玻璃体腔相关性全身免疫偏差(vitreous cavity-associated immune deviation, VCAID)[5]。目前已鉴定出3种类型的Tregs：CD4+CD25+Foxp3+ Tregs，产生IL-10的Tr1细胞和产生TGF-β的CD4+ Th3细胞，Tr1细胞在激活后只能暂时上调Foxp3，而产生TGF-β的CD4+ Th3细胞缺乏Foxp3表达[6]。其中，CD4+CD25+Foxp3+ T细胞在维持免疫自耐受和体内稳态中起着重要作用。角膜内皮(corneal endothelial, CE)细胞和色素上皮(pigment epithelial, PE)细胞等眼部驻留细胞以及眼内调节因子可以通过诱导Tregs产生促进免疫抑制性眼内微环境的发展和维持，并在免疫相关眼内疾病的发生发展中起重要作用。

二、眼内免疫负调节因子

眼内微环境中存在多种炎症调节因子，以抑制炎症激活，维护眼部免疫特权。目前已知这些负调节因子的来源是虹膜、睫状体细胞以及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial, RPE)细胞，最重要的免疫抑制因子包括免疫抑制细胞因子(transforming growth factor, TGF)- β2，免疫调节神经肽α-黑素细胞刺激激素(melanocyte-stimulating hormone, MSH)，以及膜表达的 程序性死亡受体-1(programmed death-ligand 1, PD-L1)和Fas配体(Fasligand, FasL)。

1.TGF-β2房水中含有许多免疫抑制分子，其中转化生长因子-β2(TGF-β2)为主要的抗炎分子，在Tregs的诱导和维持免疫特权的过程中起着重要作用，TGF-β2在房水中的浓度为1-10ng/ml，90%为与潜伏期相关肽结合的潜伏形式[7]。研究显示暴露于TGF-β2的APC依赖血小板反应蛋白1(Thrombospondin-1, TSP-1)的表达增加来激活潜在的TGF-β2，同时TSP-1结合APC上的受体CD36引起潜在的TGF-β2自分泌，继而在体内外诱导Foxp3+ Treg细胞的生成[8]。最近研究显示TGF-β2处理后的RPE细胞可增强CD4+ T细胞向CD4+/CD25+ Tregs细胞的分化，且与天然Tregs细胞相比，RPE细胞诱导的Tregs细胞在抑制CD4+/CD25- T细胞的增殖方面更有效[9]。

TGF- β2还可以抑制巨噬细胞的促炎功能，如炎性细胞因子的分泌或活性氧的产生，TGF-β2还可抑制APC产生IL-12，即偏离Th1反应，并减少CD40激活辅助信号[7]。同时研究表明，TGF-β2能抑制树突状细胞(dendritic cell, DC)的成熟，而阻断TGF-β2可以完全逆转房水对脂多糖诱导的DC成熟抑制作用[7,10]。

2.α-黑素细胞刺激激素 作为一种典型的免疫调节神经肽，由13种氨基酸组成的α-MSH具有抗炎和免疫调节能力。有研究显示，患有自身免疫性疾病的眼或受损的视网膜中α-MSH表达缺失，而用α-MSH治疗患有眼部葡萄膜炎等小鼠，可以抑制小鼠眼内炎症[11]。这种神经肽促进效应T细胞分化为Treg细胞，并产生TGF- β，同时α-MSH还能抑制活化的巨噬细胞和小胶质细胞介导的眼内炎症[3,12]。对先天免疫细胞的促炎信号的抑制通常是通过在巨噬细胞上表达的MC1R和MC3R介导的[13,14], 而对免疫调节的激活则是通过MC5R[15]。除了α-MSH， RPE细胞还组成性表达神经肽Y(neuropeptide Y, NPY)，产生这两种神经肽是RPE细胞调节巨噬细胞和小胶质细胞活性所必需的。NPY虽然会增强单核细胞的粘附和趋化，以及IL-1 β的产生，但NPY可以诱导产生抗炎TGF-β，且NPY对吞噬作用的影响也是矛盾的[12,16]。与α-MSH和NPY共处理的巨噬细胞表达髓样抑制细胞的特征[17]，且这种被处理过的巨噬细胞在吞噬酶体的激活和FcR介导的活性氧生成方面收到了抑制[16]。近来研究显示，此类巨噬细胞在吞噬体的成熟方面也受到了抑制，更重要的是在自身抗原加工成肽的过程中也受到了影响[12]。

3.FasL Fas是肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)的成员，是一组I型跨膜蛋白，而FasL为Fas配体，亦属于TNF家族，为一组Ⅱ型膜蛋白。Fas-FasL相互作用是维持眼内免疫特权的重要机制，病毒感染后，进入前房的炎症细胞发生依赖于Fas-FasL途径的凋亡。而在缺乏功能性FasL的小鼠中，病毒感染导致了眼内炎症及组织损伤[18]。据报道，FasL存在两种作用相反的表达形式，膜表达型mFasL与Fas结合后具有促炎作用，而mFasL被金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)裂解后产生的可溶性sFasL，与Fas结合后则具有抗炎作用[19,20]。一些研究提示sFasL可作为眼内炎症的治疗位点。单纯疱疹病毒1感染小鼠后，用sFasL治疗的小鼠角膜通过流式细胞仪及免疫组化显示相对较少的中性粒细胞。同时，靶向表达sFasL的血管内皮细胞可显著减少新生血管的形式[20]。这提示sFasL不仅能抑制角膜炎症浸润，在新生血管形成方面也有潜在治疗益处。另一项研究也显示用sFasL治疗后，患有脉络膜新生血管的小鼠新生血管侵袭减少[21]。此外sFasL可阻断mFasL诱导的中性粒细胞外渗[22]，仅表达mFasL的小鼠角膜对角膜清创术产生的无菌性炎症及LPS刺激下的炎症更敏感，而sFasL阻断了中性粒细胞流入角膜，并且对LPS诱导的角膜炎更有效[23]。眼部肿瘤诱发的炎症程度和肿瘤转移潜力也受两种FasL表达水平的影响，高表达mFasL的眼内肿瘤易诱发眼内炎症，高表达sFasL则能在眼内缓慢生长，但mFasL表达的降低和sFasL表达的升高有助于肿瘤的肝转移[19]。

4.PD-L1 PD-1及其配体PD-L1和PD-L2是共刺激分子B7家族的成员，PD-L1和PD-L2具有重叠的功能，可以协同作用来抑制T细胞活化、增殖和细胞因子的产生，PD-L1在体内起主要作用[24]。当RPE细胞暴露于炎症环境中时，表达的PD-L1水平升高，这可能是RPE细胞促进局部抗炎反应并加速炎症消退的重要途径[25]。最近研究表明在EAU小鼠模型中，阻断PD-1/PD-L1通路时，诱导的Treg细胞不能抑制效应T细胞，提示PD-1/PD-L1对Treg细胞的抑制活性[27]。

三、眼部驻留细胞

包括角膜内皮细胞及色素上皮细胞在内的眼实质细胞组成性表达CD95配体，与CD95结合后可触发炎性细胞的凋亡[28]，同时，能诱导Tregs的产生、抑制T细胞活化来维持免疫特权。CE细胞作为眼前房的内表面，与房水直接接触，通过TGF-β2来抑制CD8+ T细胞的活化，且促进CD8+ T细胞转化为Tregs。诱导产生的CD8+ Tregs高表达CD25和Foxp3，并抑制效应T细胞的激活[29]。此外，培养表达TGF-β和组织蛋白酶L抑制剂-2α(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-2 alpha, CTLA-2α)的鼠CE细胞可促进CD4+ Treg的生成，从而能够抑制效应T细胞[30]。之前研究显示虹膜色素上皮(iris pigment cell, IPE)细胞、睫状体PE细胞及RPE细胞通过不同机制抑制T细胞活化。IPE细胞通过B7-2/CTLA-4相互作用促进细胞直接接触来诱导Foxp3+/CD8+/CD25+ Tregs的产生[31]。IPE诱导产生的CD8 + Treg大量表达PD-L1共刺激分子，并通过接触依赖性机制抑制了表达PD-1的Th1细胞激活[32]。RPE细胞主要以分泌的可溶性因子来实现抑制作用，睫状体PE细胞能同时利用细胞接触及可溶性因子这两种方式来抑制T细胞[33]。RPE细胞组成性表达PD-L1，并通过PD1/PD-L1相互作用及分泌TGF-β来抑制T细胞增殖和炎症因子产生[34]。此外，在存在CTLA-2α的情况下，培养的RPE细胞通过TGF-β将CD4+ T细胞转化为Foxp3+ Tregs[35]。RPE细胞产生的视黄酸可增强TGF-β对CD4+ Tregs的诱导作用，视黄酸是TGF-β依赖性免疫应答的关键调节剂，并能够抑制IL-6驱动的Th17细胞诱导[36]。除了能抑制DC的繁殖，有研究显示RPE细胞还能诱导骨髓来源的抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells, MDSCs)的分化。RPE诱导的MDSCs为CD11+Gr+，具有T细胞抑制活性，且IL-6在诱导过程中至关重要，阻断IL-6会明显抑制MDSC的分化[35]。 据报道吲哚胺 2,3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase, IDO)是一种将必需氨基酸色氨酸分解为稳定代谢产物犬尿氨酸的酶，在干扰素- γ(interferon- γ, IFN-γ)的刺激下，RPE细胞中的免疫抑制酶IDO高度表达，且TGF-β可诱导DC中IDO表达，TGF-β/ IDO /色氨酸代谢产物轴可能参与了免疫抑制环境的维持[9]。

四、自身免疫相关眼部疾病

1.葡萄膜炎 自身免疫性的葡萄膜炎被认为是一种T细胞介导的疾病，房水和玻璃体细胞分析显示，T细胞多于B细胞[37]。而已有研究证明，α-MSH和TGF-β2诱导产生的抗原特异性Tregs可抑制EAU，LPS激活的DC诱导的CD4+CD25+Foxp3+ Tregs也能抑制CD4+CD25- 效应T细胞，过继转移时，这些Tregs也抑制EAU，即Tregs能有效抑制葡萄膜炎[1]。且研究显示免疫抑制性Foxp3+ Tregs与炎症的消退有关，RPE细胞诱导的Foxp3+ Treg能够抑制EAU小鼠的眼部炎症，此外，当眼内T细胞与RPE细胞诱导的Tregs在体外共培养时，视网膜抗原特异性细胞因子反应，如IFN-γ和IL-17降低了[38]。与活动性葡萄膜病患者相比，缓解患者中CD4+CD25+Foxp3+ Tregs的频率，TIGIT+ Tregs和T-β+ Tregs的比率以及Tregs与Th1的比率显着更高，TIGIT+ Tregs可能是临床缓解的重要预测指标[39]。在活动性葡萄膜炎期间，前房的髓样DC表达高水平的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)，但表达低水平的CD86，即炎症性的前房水仍能抑制DC的功能，这种抑制作用等于或大于非炎性前房水诱导的抑制作用[40]。

2.角膜移植 角膜移植是目前进行的实体器官移植中最成功的形式，根据以往的经验所得，若宿主角膜中存在血液和淋巴管则排斥率更高，眼内免疫抑制性微环境以及抑制性共刺激信号分子均参与角膜的免疫抑制。PD-L1在角膜内皮细胞上组成性表达，通过诱导表达PD-1的T细胞凋亡来导致排斥反应的抑制，用抗体阻断PD-L1或PD-1则可增强角膜移植后的排斥反应[41]。诱导型共刺激分子(inducible costimulatory, ICOS)mRNA也在角膜中表达，在ICOS-/-小鼠中，诱导眼睛产生ACAID的效率较低，且与野生型鼠T细胞相比，ICOS-/-T细胞对角膜内皮细胞的破坏作用增强，ICOS介导的Foxp3 + CD4 + Treg的诱导有助于成功地移植角膜[42]。此外，B7-H3、糖皮质激素诱导的TNF受体家族相关蛋白配体及而半乳糖凝集素-9也保护角膜免受T细胞的破坏，阻断其中之一都能使同种异体移植更易排斥[6]。

3.干眼 干眼(dry eye disease, DED)是一种引起眼部不适及视觉障碍的常见眼部疾病之一，免疫细胞CD4+ T细胞的活化和浸润有助于DED眼表炎症的发展。临床及实验性的DED结膜中浸润性T细胞增加，DED小鼠中的CD4+ T细胞过继转移后会导致裸鼠的干眼发展[43]。而Tregs可能提供了一种新的治疗方式，注射了DED特异性致病性CD4+ T细胞后，用CD4+CD25+Foxp3+ Tres治疗可阻止DED的发展[43]。DED动物模型及患者眼中可观察到IL-17和IFN-γ升高，而Th17细胞似乎是主动介导DED的主要效应物[44]。体内IL-17阻断不仅会导致Th17 T细胞的生成减少，更重要的是会导致Tregs功能的恢复，使DED的诱导作用和严重程度降低[45]。上文已提及TSP-1可促进TGF-β产生，在诱导Tregs中起重要作用。缺乏TSP-1的小鼠表现出泪腺炎性浸润、泪腺功能障碍及杯状细胞密度降低相关的角膜上皮屏障受损[46]，且小鼠结膜中CD4+ T细胞浸润比野生型小鼠高出近三倍[45]。TSP-1自身也可以抑制T细胞活化，并促进Tregs细胞生成，自身免疫相关的眼表疾病可能与TSP-1缺乏有关[46]。已有越来越多的证据显示眼部免疫负调节剂和Tregs的活化可以保护自身免受炎症损害，是保持眼部微环境和良好视力的功臣。而在生理情况下，它们又积极参与维持眼部免疫特权，防止过度眼部炎症引起的组织损伤。

随着技术发展，一定会有更多调节免疫环境的因子被发现，成为葡萄膜炎等免疫相关眼部疾病的治疗靶点。同时不少研究证明视网膜变性、糖尿病性视网膜病变等视网膜血管疾病也与免疫相关，而Tregs也在控制疾病进展中起重要作用[5]。对眼部免疫特权维持机制的进一步研究，对Tregs功能的了解以及新的免疫调节因子的发现可能为眼部自身免疫性治疗干预提供一种新方法。