HIF-1α与TDAG8在低氧性肺动脉高压发病中的研究进展

徐海燕 孔玉红 徐喜媛 杨敬平

作者单位：014010 内蒙古 包头，内蒙古医科大学第三附属医院呼吸与危重症医学科，内蒙古呼吸与危重症医学研究所

肺动脉高压(PH)是一组临床特征为肺循环压力的异常升高，最终导致右心室衰竭和死亡的疾病[1]。根据病理生理机制、临床表现、血液动力学特征及治疗方法，PH在临床上分类，分为五类[1]。低氧启动的低氧性肺血管收缩及肺血管重塑，致低氧性肺动脉高压(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的形成[2]，为PH分类的第3类[1]。当低氧时肺血管平滑肌受各种调节因素调控，发生肺血管重塑时，表明HPH形成[1-2]。近年来，HIF缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor 1-α, HIF-1α)通过调节血管生成、红细胞生成、炎症和增殖的数百种基因，在HPH发病中起关键作用[3]。在HPH发病中低氧造成的微酸环境与质子感知受体TDAG8相互作用，发挥重要作用并逐渐引起研究者关注[4]。本文探讨HIF-1α及TDAG8在HPH发病中的作用，进一步了解HPH发病新进展。

HPH发病中肺血管收缩及肺血管重塑的研究

HPH的主要改变为低氧引起的肺血管收缩及肺血管重塑[3]，低氧性肺血管收缩的研究较为深入。急性低氧触发广泛的肺血管收缩，可导致急性右心室后负荷增加[5]。慢性低氧最初发生肺动脉收缩，从最初的几个小时就可以启动缺氧性肺血管重塑的网络化病理生理学改变；随着低氧时间延长，发生肺动脉重塑的病理改变，成为HPH的标志并决定了HPH的严重程度[5]。病理改变主要为平滑肌细胞增殖和肥大，胶原蛋白和弹性蛋白等细胞外基质蛋白沉积增加，外膜或循环细胞的募集等[5]。

HPH肺血管重塑中，肺动脉内皮细胞(pulmonary artery endothelial cells, PAEC)与肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells, PASMC)之间相互作用，导致病变发生及进展[6]。PAEC具有屏障和分泌作用，急性缺氧时整个肺血管床发生血管收缩，其中，无肌肉末端小动脉、毛细血管和小静脉等微血管区域的PAEC收缩 ，根据泊肃叶定律，将导致血管阻力增加了34%[7-8]。低氧诱导的内皮源信号发生TRPC6的移位，同时激活PLC和RhoK触发PASMC收缩。这种传导以肌内皮连接的形式存在，该连接允许去极化或超极化在相邻的内皮细胞和平滑肌细胞之间扩散，并促进蛋白质信号在内皮细胞和平滑肌细胞之间传导[7-8]。使用磁共振成像发现低氧时PAEC作为相邻层流变化和非层流血流变化的传感器，导致剪切应力的变化引起PAEC从基因表达的改变到引起一系列内皮功能的改变，如ROS引起RhoA / ROCK的激活、内皮一氧化氮合酶(eNOS)合成异常、释放血管活性介质及多种生长因子，激活HIF-1α表达，均影响平滑肌的生长，导致血管重塑[7-8]。HPH患者的PAEC对生长因子有高度增生作用，并表现出很高的糖酵解率，形成局部微酸环境，调节质子感知受体的表达，并诱导炎症反应发生[8]。研究表明，PAEC暴露于高水平的剪切应力下，三周会导致高度增殖的表型的发展，并减少细胞凋亡,并诱导炎症反应发生[8-9]。其中，HIF-1α为近年来在HPH发病中研究的热点，在肺血管重塑中起关键作用。

HIF-1α在HPH发病中的研究进展

大量研究证明，HIF-1α可以通过调控PASMC细胞内离子、离子通道及pH值平衡，调节血管生长因子和Warburg效应(Warburg effect)及诱导炎症反应影响平滑肌增殖。

急性缺氧导致PASMC细胞内钙离子增加，导致血管收缩，常氧后可恢复正常。慢性缺氧时钙离子通道因细胞内钙离子存储的耗竭而激活，钙离子内流增加，PASMC中基线钙离子升高，在恢复常氧后也不能回复[10]。研究表明[10-11]，PASMC膜中K+通道的开放会增加K+流出，从而引起膜超极化。这关闭了电压依赖性Ca2+通道，减少了Ca2+的进入并导致血管舒张。相反，抑制K+通道会导致膜去极化，Ca2+进入，细胞收缩和血管收缩。细胞外酸中毒和低氧下调或抑制KCNK3基因(编码外向K+通道)导致PASMC去极化,Ca2+进入产生肺动脉血管收缩并通过激活Ca2+敏感通路使PASMC增殖。小鼠神经母细胞瘤细胞KCNK3基因敲低，可使增殖率增加25%，药理抑制或基因干扰KCNK3可以通过HIF1-α和ERK1/2、AKT和SRC的磷酸化，激活促进PASMC增殖和抗凋亡[11-12]。研究表明：缺氧小鼠的PASMC中，与钙离子相关的瞬时受体电位TRPC1和TRPC6 蛋白表达均增加[3]；ET-1表达增高可以增加TRPC1 / TRPC6表达，并抑制了电压依赖型钾通道Kv 1.5和Kv 2.1 mRNA和蛋白表达[13]，进行HIF-1α+/-处理后，小鼠在慢性缺氧时PASMC内基线钙离子及TRPC1/TRPC6表达并没有增加[3, 13-14]。研究发现：Na(+)/ H(+)交换物(NHE)在慢性低氧小鼠PASMC中的表达和活性增加，并导致PASMC中的pH增加，有助于PASMC肥大和增生信号传导途径的激活，这一过程可以被HIF-1α调节[15]。

HIF-1α激活编码血管生成生长因子的转录，HIF-1α直接与编码VEGF，基质细胞衍生因子(stromal-derived factor 1，SDF-1)，血管生成素2(Angiopoietin 2，ANGPT2)和干细胞因子(Stem cell factor, SCF)的基因的启动子中的结合反应原件结合[16-17]。血管生成生长因子(以VEGF为主)依赖性于HIF-1α刺激内皮细胞为主的多种血管细胞，这些细胞均有同源受体(VEGFR1或VEGFR2)表达,促血管生成[16]。血管内皮生长因子A(VEGF-A)，其关键的调节途径之一是表皮生长因子受体(EGFR)信号传导途径。它可以通过VEGF及NDRG3/Raf-ERK途径促进血管重塑[16-17]；调节EGFR信号通路的VEGF表达的主要下游通路是PI3K-AKT，RAS-MAPK和JAK信号转导子和转录激活子(STAT)信号转导通路。这三个转录因子与VEGF-A mRNA的启动子结合，然后促进VEGF-A mRNA的表达并增加VEGF-A的分泌[17]。调节该下游信号传导途径的重要因子是HIF-1α、STAT及转录因子第二成分1(SP1)[16-17]。

HPH的PAEC也会发生从氧化代谢到糖酵解的HIF-1α依赖性重编程。HIF-1α还可通过Warburg效应，促进PASMCS增殖。低氧条件下导致HIF-1α的积累，抑制了丙酮酸进入线粒体完成氧化磷酸化，大部分通过细胞质中乳酸脱氢酶转化为乳酸。研究表明[18]，PDGF可通过PI3K/AKT/mTOR/HIF-1α信号转导通路，增强Warburg效应促进PASMC增殖，参与肺动脉高压的形成。乳酸可通过低氧诱导因子HIF-1α诱导巨噬细胞向M2型极化，促进VEGF的表达，产生增殖作用[18]。

炎症也参与了HPH的发病，低氧及HIF-1α均可参与先天免疫及获得性免疫的调节。T细胞受体/ CD3抗原复合物可激活HIF-1α表达。细胞葡萄糖代谢和脂肪代谢在T细胞分化为辅助性T细胞17 (helper T cells17，Th17)/调节性T细胞的过程中起着重要作用，HIF-1α调节Th17细胞/调节性T细胞之间的平衡[19]。辅助性T细胞17和维持/调节性T细胞失衡可通过ROCK信号通路影响STAT3/STAT5磷酸化,导致PASMCS的增殖[19]。在慢性低氧时，大鼠血清IL-6的增加，并通过JAK2 / STAT3途径的激活诱导MMP-9的上调；STAT3抑制剂可下调MMP-9表达，并减弱缺氧诱导的微血管变化，表明IL-6/JAK2/STAT3/MMP-9途径参与低氧微血管增殖调节及肺血管重建[20]。NF-κB的活性受NF-κB(IκB)激酶(IKK)抑制剂(主要是IKKβ)的调节，以响应感染性或炎性刺激。在缺氧条件下，NF-κB有助于增加HIF-1α mRNA的转录,HIF-1α介导了缺氧条件下的中性粒细胞的NF-κB激活和促进NF-κB调节的细胞因子TLR4的表达。低氧情况下，缺氧诱导因子HIFα和HIF-β亚基移位至细胞核，以异二聚体的形式与缺氧反应启动子元件(HRE)结合，诱导多基因的转录，包括NF-κB和TLRs的表达[21]。在MDSC(髓样来源的抑制细胞)中，低氧条件下，HIF-1α与PD-L1(程序性死亡配体)近端启动子中的缺氧反应元件(HRE)结合，直接靶向，使细胞产生IL-6、IL-10[22]。许多研究证实，丙酮酸激酶在糖酵解中具有关键作用，在LPS活化的巨噬细胞中可通过HIF-1α调节IL-1β表达[23]。研究表明：低氧时PAEC上调IL-33及其受体ST2表达，以ST2依赖性方式激活HIF-1α/ VEGF轴，引发血管平滑肌细胞重塑[24]。

HIF-1a可通过不同信号转导通路进行自身调节。研究发现[25]，已知HIF-1a受生长因子、细胞因子和细胞分裂素的调节，低氧条件下，可通过MAPK/ERK、PI3K/AKT/mTOR、cAMP/PKA、NF-kB等通路可诱导HIF-1a的活化。研究证实HIF-1α的表达依赖于表皮生长因子。表皮生长因子与表皮生长因子受体，激活PI3K/aKT信号通路，诱导HIF1α的稳定表达。在低氧环境下，EGFR/Akt/mTOR通路是已知的HIF1a的正向调节因子。有研究表明,FAT1是跨膜蛋白,定位在人类染色体4q34-35上，缺氧条件下FAT1在HIF-1a表达中的上游起调控作用[17, 25]。

质子感知受体TDAG8的作用及在HPH发病中的研究进展

G蛋白偶联受体家族(G Protein-Coupled Receptors，GPCRs)是一类膜蛋白受体的总称，包括OGR1、GPR4、G2A和TDAG8等质子感知受体，这类受体在正常组织细胞包括心、脑、肺、肾等脏器及人的各种肿瘤细胞中广泛分布，被细胞外酸化激活，促进离子稳态和对稳态干扰(如酸碱平衡)的适应性反应，其中的GPR4和TDAG8对质子感知最强[4]。膜蛋白受体上，大多数蛋白质的可电离残基在pH 5～7.4之间恒定带电，对生理pH值变化不敏感，GPCR包含可电离的残基传感器(pH传感器)，包括天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、精氨酸和赖氨酸五个氨基酸可以检测质子，这些残基可响应生理pH的变化而不充电，从而调节蛋白质的结构并转导细胞外质子信号，以激活细胞内信号传导途径，并引发适当的细胞应答[26]。TDAG8的pH传感器以酸性三联体的出现，并且GPR4和GPR68都可以通过受体胞外域上、组氨酸残基调节三联体，诱导构象变化，激活G蛋白和下游信号传导，调节炎症反应及平滑肌增殖[26]。细胞可以通过多种分子传感器来感知细胞外酸化，如酸敏感离子通道(ASIC)，瞬时受体电位和质子感知受体(TDAG8及OGR1)激活多个G蛋白信号通路和下游信号传导，引起肺血管收缩及肺血管重塑[4,26]。TDAG8在酸性环境中敏感度最高，且在受体内广泛分布，参与介导多个信号转导通路，是目前值得关注的明星受体[4]。酸中毒对质子感应GPCR的激活可转导多个下游G蛋白信号通路，四个GPCR中的每一个都与一个或多个G蛋白偶联：GPR4(Gs，Gi/o，Gq /11和G12/13)，GPR65(Gs)，GPR68(Gs和Gq /11)和GPR132(Gs和G12/13)[4,26-27]。研究表明，TDAG8主要分布在增殖细胞核抗原(PCNA)阳性的血管平滑肌细胞中，TDAG8基因沉默可以抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移，在过表达TDAG8的血管平滑肌细胞中，cAMP水平升高且促进其增殖，表明TDAG8通过cAMP / PKA信号通路影响血管的重塑[28]

缺氧和炎症在以多种方式相互影响，炎症可由缺氧引起的，缺氧通过调节HIF-1α加重炎症，通过Warburg效应使葡萄糖代谢为乳酸产生局部组织微酸环境，酸性环境不仅是炎症的结果，还诱导病理差异转录程序相关基因产生促炎细胞因子表达，进一步调节生长因子、影响凋亡，导致肺血管平滑肌增殖[18,29]。Vallière研究团队发现，缺氧通过HIF-1α的稳态来改变厌氧葡萄糖组织代谢中pH的表达，正向调节GPCR的表达，证实了HIF-1α对GPCR的表达有调节作用[30],且可通过Warburg效应促进PASMCS增殖[18]。TDAG8在巨噬细胞、中性粒细胞以及T细胞和B细胞分布广泛，可调节巨噬细胞中胞外酸化诱导的炎性细胞因子、中性粒细胞中超氧阴离子的产生和嗜酸性粒细胞的存活反应[28-29]，TDAG8与Gs结合激活腺苷酸环化酶(adenylate cyclase，AC)，磷酸化的cAMP反应元件结合(pCREB)蛋白水平上调，通过PI3K-AKT信号通路及NF-KB信号通路调节炎症细胞的凋亡，并通过前述的炎症机制参与HPH发病过程[19-22，29,31-32]。研究表明，TDAG8通过趋化因子的产生及调节炎症水平影响肺血管重塑，例如影响C-C基序趋化因子22配体(CCL22)、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-25的表达[33]。研究表明，TDAG8在HPH大鼠肺组织、肺血管和外周血明显组增加，且校正分析结果进一步提示TDAG8在肺组织、肺血管和外周血中具有高表达一致性。该研究表明，HPH模型大鼠TDAG8通过不同途径调节CCL22、TNF-α、IL-25表达[33]。CCL22参与免疫调节和炎症过程，与趋化因子受体CCR4结合，激活T淋巴细胞等，TNF-α与促炎细胞因子的产生有关，IL-25通过Th2淋巴细胞诱导NF-κB、IL-5、IL-8等炎症因子细胞导致炎症反应，参与了HPH的发生[33]。表明TDAG8通过缺氧诱导的炎症反应在HPH发病中起重要作用。PAEC摄取的乳酸可激活上调IL-8依赖性的PASMC增殖，并且乳酸使HIF-1α上调，促进VEGF相关PASMC增殖[34]。实验表明：低氧导致的酸性环境中，TDAG8显著促进了HIF-1a的表达,HIF-1通过羧酸转运体( monocarboxylate transporters，MCTs)，将乳酸转运出细胞，造成细胞外的酸性微环境，从而诱导酸性环境敏感质子感知受体TDAG8表达激活，由此形成HIF-1α及TDAG8的正反馈通路，共同在HPH发病中起作用[34-35]。上述研究表明TDAG8在低氧及酸性环境中对HPH发病起重要作用，HIF-1α与TDAG8相互调节在HPH发生发展中起重要的作用。

目前，有关HIF与TDAG8相互作用调节HPH的研究较少，但由于低氧导致的微酸环境中，TDAG8可以调节多种肺血管变化，必然与HPH主要的调节因素HIF产生相互作用，对于HIF-TDAG8相互影响的探讨将有助于开拓HPH发病机制研究新思路。