外泌体在肺癌诊断中的应用研究

郝昱 徐兴祥

作者单位：225000 江苏 扬州，苏北人民医院呼吸与危重症医学科

肺癌是全世界发病率和病死率最高的恶性肿瘤，一直威胁着人类的健康，四分之一的癌症死亡是肺癌，大多数肺癌确诊时已是晚期阶段，5年相对生存率仅有大约16%～19%[1]。肺癌的传统治疗方法是基于组织活检中癌细胞的组织病理学分析，但因为其有创性，患者需要承担较大的风险，因此，寻找有效的肺癌早期筛查手段已成为一个亟待解决的问题。外泌体作为液体活检其中的一种成分，因其获取的非侵入性、可重复性、成本低等优点用于诊断肺癌已经成为一个研究热点话题[2-3]。目前已经有研究表明，外泌体在肺癌发生发展的肿瘤微环境、肺癌的侵袭和转移、免疫调节、参与放化疗抵抗中，分别都发挥着重要作用。尤其是外泌体所含的蛋白质、miRNA等成分已经研究证实对于肺癌的早期诊断有重要价值，具有作为新的早期诊断标记物的潜力。本文主要将从外泌体作为液体活检标记物在肺癌中的生物学作用与应用于肺癌方面进行综述。

外泌体概述

在人体的多种体液中都能够发现外泌体的存在，例如脑脊液、唾液、胸腔积液、乳汁、腹水、血液、精液、尿液等。外泌体来源于晚期的内吞体，又称为多囊泡体,(multivesicular bodies, MVB) , 是体内活细胞通过内吞-融合-外排等一系列生物学过程而形成的具有脂质双层膜结构的多囊泡体, 它们的直径大约在30～100 nm，密度在1.13～1.19 g/m1。外泌体的生物成分中含有蛋白质、核酸(DNA、mRNA、miRNA、其他非编码RNA)、脂质等[4-5]。外泌体最初是在1987年，Johnstone 等人在研究网织红细胞成熟的过程中，对绵羊红细胞上清液进行超速离心时发现的[6]。最初人们认为外泌体是细胞丢弃的“垃圾”，在1995年Raposo等人发现被EB 病毒感染的 B 淋巴细胞释放的外泌体携带了适应性免疫应答所需要的膜结合分子[7]。从而发现外泌体可能具有改变细胞外微环境、呈递抗原、刺激T细胞增殖、诱导机体免疫反应等功能。

一、外泌体的生物发生

外泌体生物发生最重要的一个机制是ESCRT依赖机制，ESCRT是由四种蛋白质复合物和辅助蛋白质组成(ESCRT-0、ESCRT-I、ESCRT-II、ESCRT-III和Vps4)。这一机制的过程包括从内芽形成细胞内小体，到多泡小体的产生，到多泡小体的融合成有质膜的细胞体，然后将外泌体释放到胞外[8]。外泌体形成的另一个机制涉及到神经酰胺的合成，它诱导囊泡弯曲和出芽[9]。外泌体生物发生的第三种机制是四跨膜蛋白介导的特定蛋白质组织，如淀粉样蛋白和前黑质体蛋白[10]。

二、外泌体的主要成分

已知的一些数据库，如ExoCarta (http://www.exocarta.org)给出了外泌体各种成分较为全面的表述，已研究出外泌体含有41 860种蛋白质、3 408种mRNA、2 838种miRNA和1 116种脂质。研究发现外泌体中存在多种蛋白质，它们能参与外体的生物发生(ESCRT复合物，Alix，TSG101)、抗原提呈(抗原提呈因子)、膜转运和融合(Rab GTPases和膜联蛋白)，外泌体还富含热休克蛋白(HSP70、HSP90)、整合素、四磷酸腺苷(由CD63、CD9、CD81、CD82和四种跨膜蛋白组成的超家族，它们通常被认为是外泌体标记)、MHC Ⅱ类蛋白、上皮细胞粘附分子(EpCAM)和人类表皮受体家族成员[11-12]。另外外泌体中主要含有胆固醇(CHOL)、鞘磷脂(SM)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰乙醇胺(PE)、二酰甘油(DAG)、磷脂酸(PA)、磷脂酰肌醇(PI)等多种脂质成分[13]。miRNA是一系列内源性的非编码小核糖核酸分子(18～22个核糖体)，与mRNA的3′UTR结合引起靶mRNA的降解或者翻译抑制。miRNAs可以通过外泌体主动分泌并传递给其他细胞或肿瘤细胞，从而保护它们不被降解。外泌体miRNAs能在新的受体细胞中有效地发挥作用。外泌体的miRNA谱与原发性肿瘤的miRNA谱具有相似性，外泌体miRNAs的特征可能反映了原始肿瘤细胞的特征，有作为生物标记物的潜能[14]。

外泌体在肺癌发生发展中的生物学作用

1)促进上皮-间充质转化(EMT)：来自缺氧的骨髓间充质干细胞(BMSC)的外泌体miR-193a-3p、miR-210-3p和miR-5100通过激活STAT3信号诱导的EMT，促进了肺癌细胞的侵袭和转移[15]。2)刺激血管生成：来自于人类肺癌A549细胞的外泌体分拣蛋白(Sortilin)是外泌体在细胞通讯介导中的关键成分，它与原肌球蛋白相关激酶B(TrkB)、表面生长因子受体(EGFR)组成的TrkB-EGFR-sotilin复合物也叫做TES复合物，这种复合物在体外有迁移和激活内皮细胞的功能，从而在促进肺癌血管生成中发挥重要作用[16]。3)在肺癌微环境中调节免疫反应：肿瘤来源的外泌体可以与体内的免疫系统的正常细胞相互作用，使产生抑制正常免疫作用的异常细胞增多，使抗原提呈细胞(APC)减少、抑制T细胞及NK细胞，从而导致免疫监视减少，进一步促进肿瘤细胞的生长和转移侵袭[17]。外泌体在肺癌的免疫逃逸过程中发挥了重要作用。4)促进肺癌转移前生态位的形成：研究者从原发性小鼠肺癌细胞中收集了外泌体，并从中分泌出RNA，通过II型肺泡上皮细中的NF-κB和MAPK途径使TLR3(Toll样受体3)表达上调，促使趋化因子产生和中性粒细胞聚集，进而促进转移前生态位形成[18]。

外泌体在肺癌早期诊断中的作用

组织活检一直作为肺癌诊断的“金标准”，但是其具有创伤性大、依从性差、操作过程复杂等缺点。外泌体作为一种液体活检技术的检测标记物能够在人体的多种体液中获取，有效的反映其亲本细胞，具有创伤性小、样本易获取，并且能够实现动态监测等优点。外泌体的各种生物成分，如miRNA、蛋白质等在肺癌中存在异常表达，外泌体的这些生物成分具有作为肺癌诊断标记物的巨大潜力。

一、外泌体蛋白作为肺癌诊断的标记物

ADAM是一种去整合素和金属蛋白酶，Yoneyama等人的一个首次将酶特异性蛋白水解活性作为潜在的癌症生物标记物的研究利用PrAMA(蛋白水解酶活性矩阵分析)推断ADAM10sa(ADAM10 sheddase activity)在非小细胞肺癌患者的外显体上选择性增加，这不仅能准确区分NSCLC肿瘤患者与健康人，而且能准确区分NSCLC肿瘤患者与炎症性或良性肿瘤性肺病患者，因此，此种蛋白质可作为一种重要的NSCLC检测生物标记物[19]。为了验证外泌体蛋白作为生物标志物的潜力，研究者选择了一组高表达的蛋白，结果表明，在LLC胞体中CDK1和CDK3含量较高，KRAS在这三种类型的癌细胞的外泌体中均含量丰富，而PPP1CA和CDC42在三种细胞中均未检测到[11]。外泌体蛋白质的种类繁多，针对肺癌诊断的特异性研究较少，不同体液来源的外泌体蛋白质都具有作为肺癌标记物的潜能，值得期待的是多种外泌体蛋白质组成的联合标记物将具有较高的临床价值。

二、外泌体miRNA作为诊断标记物

miRNA被包裹在微泡或者外泌体中使其能够稳定的存在于体液中，对miRNA的研究分析能够反应亲本细胞的状态。研究者对12例NSCLC患者和6名健康者的血浆进行外泌体分离，通过qPCR技术分析了在NSCLC中选择的8个被解除调控的特异性miRNA，发现NSCLC患者血浆选择的外泌体miRNA相对于正常健康人的表达上调或者下调。由此可见NSCLC患者血浆外泌体miRNA可以作为一种疾病诊断工具[2]。实验通过同时检测8种血清miRNA和相应的血清外泌体miRNA，发现了4种血清miRNA(miR-21-5p，miR-1413p，miR -222-3p，miR-486-5p)和2种血清外泌体miRNA(miR-146a-5p的和miR-486-5p)在NSCLC的早期患者中具有诊断价值，进一步研究证明血清外泌体miR-146a-5p和miR486-5p在早期NSCLC诊断中的表现优于其相应的血清miRNA和其他6种血清miRNA，由此可见在早期NSCLC诊断中血清外泌体miRNA比血清miRNA可能更有价值[20]。随着对液体活检技术的不断探索，很多研究证实，来源于肺癌的外泌体相关miRNA在肺癌诊断中有巨大潜力，但是目前来看针对肺癌的外泌体特异性miRNA还很少，外泌体特异性miRNA或者多种miRNA组合作为有效的筛查手段还在进一步的探索状态，需要更多的实验及密切结合临床来验证。

外泌体与肺癌的治疗与耐药

研究发现当使用不含IFN-γ的树突状细胞来源的外泌体治疗晚期NSCLC时，外泌体能够发挥自然杀伤(NK)细胞的功能，随之进行的Ⅱ期试验，更进一步验证了外泌体可以在NSCLC患者体内增强NK细胞抗肿瘤免疫性的能力[21]。研究者发明了一种用于肺癌治疗的金纳米颗粒-外泌体(Exo-GNP)的治疗性药物传递系统——“nanosomes”，该系统由通过物理上负载在外泌体上的pH可裂解键与抗癌药阿霉素(Dox)偶联的GNP组成，该系统的使用比单独使用Dox相比，具有更快的药物释放速率，更低的化疗毒性，从而使化疗效果增强[22]。不管是固有的还是获得性的化学疗法产生耐药性，是癌症治疗中最基本的问题之一，并引起局部和远处的肿瘤复发以及疾病进展。外泌体作为细胞间传递信息的信使，研究发现它在肺癌药物治疗过程中产生耐药方面也存在它的身影。在非小细胞肺癌中携带T790M突变的EGFR-TKI耐药细胞H1975释放的外泌体miRNA-522-3p通过激活PI3K/AKT途径将耐药特性传递给EGFR-TKI敏感细胞PC9，抑制吉非替尼的治疗作用、促进PC9细胞对吉非替尼的耐药，并促进体内肿瘤的生长[23]。

总 结

随着人类医疗水平的进步，肺癌的发病率仍然持续升高，这与肺癌的发病因素复杂密切相关。尽管肺癌的诊断技术及治疗方案较以往有了较大的进展，但是肺癌的诊断难度大、治疗效果不佳，仍然是困扰我们的一大难题，因此寻找更多简便有效的肺癌诊断及治疗方法是一个亟待解决的问题。外泌体作为一种新型的液体活检标记物，因其包含多种蛋白质、核酸等生物成分，可以在细胞之间起到细胞间通讯及调节细胞各种生理反应等重要作用，肺癌细胞也可以利用外泌体这种细胞间信息传递的功能帮助构建一个良好的细胞生存的微环境来支持肺癌细胞自身的发生发展、转移侵袭以及对治疗的抵抗。因此外泌体可能作为肺癌早期诊断、治疗过程及判断预后的动态标记物。近年来对于外泌体有关的生物活性物质的研究越来越多，但是大部分仍处于实验阶段，面临许多问题，如样本数量受限、标本选择存在争议、外泌体分离及提纯的标准不确定等。外泌体在肺癌中的应用应该密切结合临床实际情况，全面了解外泌体在肺癌中的发生作用的机制等，相信随着未来研究的进展，外泌体的各种生物成分有望成为帮助诊断肺癌的生物标记物，并且在肺癌的治疗及预后方面有着巨大的潜力。