内源性大麻素抗肺纤维化的作用研究进展

喻娟娟综述 欧维琳审校

内源性大麻素系统主要由大麻素受体(CBR)、大麻素及合成与降解内源性大麻素的酶组成[1]。生物体内主要的大麻素受体是大麻素Ⅰ型受体(CB1R)、大麻素Ⅱ型受体(CB2R)，它们都是G蛋白偶联受体，大麻素发挥生物活性效应的主要化学物质是△9-四氢大麻酚(△-THC)。现有研究证实，内源性大麻素可通过与受体结合触发不同的信号传导通路，发挥多种病理生理作用，主要通过免疫系统调节炎性反应，抑制炎性细胞释放炎性因子，如对肝炎、肺部炎性反应、结肠炎等炎性调节作用[2-4]。纤维化是组织被炎性反应等刺激后发生的一种修复或反应的病理过程，主要表现为纤维结缔组织的过量形成和沉积，最终导致组织器官结构和功能的不可逆性损伤，文献报道，内源性大麻素对心肌梗死后心肌纤维化、肝硬化、肾纤维化等有抗纤维化作用[5-7]。大多数呼吸系统疾病因呼吸道炎性反应反复发生最终发展成肺纤维化，其发病机制复杂，尚不完全清楚，其中一个重要病变过程是长期反复炎性反应刺激导致气道重构，肺功能发生不可逆损害，国际上暂时还没有有效逆转肺纤维化的药物。内源性大麻素经其代谢途径抑制炎性反应，逆转气道重构延缓肺纤维化的研究值得人们关注，大麻素受体或许是治疗肺纤维化的一个新靶点。文章就内源性大麻素及其抗肺纤维化作用机制与调节通路进行综述。

1 内源性大麻素概述

1.1 内源性大麻素及大麻素受体 Di Marzo和Fontana等最先提出内源性大麻素系统由内源性大麻素、大麻素受体，以及涉及内源性大麻素合成、运输和降解的酶所构成。内源性大麻素主要通过2种特异性大麻素受体发挥作用即CB1R和CB2R，CB1R和CB2R均为G蛋白偶联受体(GPCRs)(Gi/o)，这2种受体主要通过7次跨膜发挥生物学效应。CB1受体主要分布在神经系统、神经末梢和脂肪组织等多种组织中，CB2主要在具有免疫功能的外周器官中表达，如扁桃体、脾脏、胸腺、骨髓、肺、肝脏[8-11]。CB2R主要依赖K+通道和Ca2+通道，对内源性大麻素在体内的代谢进行调节。

1.2 内源性大麻素活性成分 1964年Gaoni和Mechoulum首次提取出大麻素发挥生物学效应的主要分子Δ9-四氢大麻酚(THC)，1992年在哺乳动物猪脑中分离出的第一种内源性大麻素相关物质N-花生四烯酸乙醇胺(N-AEA)。在随后几年中，人们发现了多种活性内源性大麻素物质，主要是花生四烯酸与乙醇胺或甘油结合的衍生物，2-花生四烯酸甘油乙醚、O-花生四烯酰乙醇胺及N-花生四烯酰多巴胺等[12-13]。

2 内源性大麻素抗肺纤维化的机制

2.1 参与免疫调节 内源性大麻素及其受体在免疫系统表达并参与免疫调节作用[14]，如CB2受体参与B细胞分化、巨噬细胞迁移和抗原处理，大麻素受体通过产生一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)参与肥大细胞活化。过去大多数研究都集中在内源性大麻素系统对中枢神经系统的影响上，但其在免疫、心血管、胃肠道和呼吸系统中具有多种生物学效应[15]。近年来研究表明具有免疫调节功能的内源性大麻素系统是治疗炎性疾病及纤维化疾病的靶点之一[16]。文献报道，CB2R通过参与B细胞分化、巨噬细胞迁移和磷酸化、抗原处理在免疫调节中发挥抗炎作用。内源性大麻素和大麻素受体的激活可通过减少炎性细胞的募集和增加抗炎细胞因子的产生来抑制肝炎、肺炎、结肠炎中的炎性反应[2-4]。有研究表明，用CB2R激动剂HU308对小鼠盲结肠穿孔引起的脓毒症进行干预，结果表明CB2R激动剂HU308可减轻脂多糖对巨噬细胞的刺激，使促炎因子TNF-α、IL-18、IL-1β和NLRP3的表达降低[14]，说明CB2R通过抑制巨噬细胞释放促炎因子减轻肺部炎性反应损伤。

2.2 降解胶原纤维 纤维化的一个主要病理改变是基底膜增厚，基底膜由大多数上皮细胞和内皮细胞的细胞外基质构成[17]，细胞外基质和胶原沉积是基底膜增厚的一个重要表现，在各种生物学过程中发挥着重要作用，特别是在实质损伤后的组织重构中。肺组织细胞外基质的大分子由肺成纤维细胞(FB)分泌的纤维蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白)、结构蛋白或黏附蛋白(纤维连接蛋白和层粘连蛋白)组成[18]，这些组成细胞外基质的大分子物质嵌合在透明质酸(HA)等糖胺聚糖的水合多糖凝胶中。成纤维细胞在炎性介质刺激下转变为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞是Ⅰ型胶原蛋白(ColⅠ) 和纤维连接蛋白(FNⅠ)的主要来源，Col Ⅰ被认为是气道重构的早期标志，是体内含量最丰富也是分布最广泛的胶原，Col Ⅰ的沉积可引起气道壁增厚和僵硬[19-20]。FN 是一种黏附性糖蛋白，在 Col Ⅰ合成之前就已经产生，能够刺激上皮细胞、成纤维细胞等细胞产生胶原纤维，不仅使大、小气道内胶原纤维增多，而且高度紊乱、碎片化参与气道重构[21]。大麻素受体的激活可以降解胶原纤维，心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是心肌细胞受损后发生间质化且伴随大量胶原纤维的沉积导致心脏结构重构，可引起慢性心功能不全、恶性心律失常等事件的发生，并出现心功能进行性衰竭[22]。研究表明，内源性大麻素系统中CB2 受体激活可促进干细胞(如造血干/祖细胞和神经祖细胞)的增殖，心脏祖细胞激活和增殖在心肌梗死后心肌内源性再生和修复中发挥重要作用。用CB2 受体激动剂AM1241干预通过调节PI3K/Akt/Nrf-2信号通路促进心肌梗死后心肌内源性再生,改善心脏功能和心脏结构重构,近年来用大麻素受体激动剂AM1241干预心肌梗死后心肌纤维化的研究发现，CB2受体激活可降低心脏组织Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维粘连蛋白、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP)、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)，同时还发现大麻素受体激动剂AM1241可抑制缺氧状态下心肌成纤维细胞的分泌和转型，从而改善心肌重构改善心肌纤维化[6]。

2.3 抑制成纤维细胞分泌 肺成纤维细胞在肺纤维化的发生过程中起着重要的促进作用，主要通过自身的异常增殖与转型，大量分泌细胞外基质直接触发肺纤维化和作用于上皮细胞及一些炎性细胞间接参与肺纤维化进程。随着成纤维细胞数目的不断增加，肺部成纤维灶逐渐形成，并且逐渐取代正常的肺细胞组织，这是肺成纤维细胞通过细胞增殖转型引起肺部结构的异常重构，进而触发肺纤维化。但是在肺纤维化过程中部分成纤维细胞灶的细胞可能由其他肺部细胞如上皮—间质转化而来，肺泡上皮细胞向间质细胞转化。肾小管上皮细胞向肾纤维细胞转化导致肾纤维化的发生。肾脏中存在一个完整的内源性大麻素系统，内源性大麻素系统激活后抑制成纤维细胞分泌，降低肾组织成纤维的含量，肾脏纤维化是炎性反应刺激或免疫等因素所致肾间质胶原大量沉积、瘢痕化的一种病理表现，其纤维化的病因与肺纤维化的主要病因类似，都存在上皮间质转化途径。内源性大麻素系统有抗肾纤维化的作用，文献报道[7]，肾脏内源性大麻素系统通过CB2R在炎性细胞或实质细胞上的信号传导产生抗炎作用并降低炎性反应引起的纤维化，而通过CB1R的信号传导促进氧化应激和炎性反应，导致细胞凋亡和纤维化，CB1R和CB3R之间可能存在相互制约的作用。在Ⅰ型糖尿病肾病、慢性肾纤维化、药物性肾小管损伤的动物模型中，当CB1R信号高于CB2R时导致氧化应激和炎性反应，随后出现细胞功能障碍、调亡和纤维化，而抑制CB1R激活CB2R可减少炎性反应和纤维化的发生。大麻素Ⅱ型受体通过抑制巨噬细胞释放促炎因子减轻组织炎性反应，通过降低胶原蛋白、纤维粘连蛋白、抑制成纤维细胞的分泌改善组织重构延缓纤维化的发生。

2.4 调控平滑肌细胞增生 气道平滑肌细胞发生增生、肥大、迁移和凋亡抑制，同时表达和释放细胞因子、生长因子及蛋白酶类，可导致上皮下基膜增厚和细胞外基质沉积，引起气道重构，是最终引起肺功能下降的主要原因。在肝纤维化中，内源性大麻素系统同样发挥抗纤维化的作用，肝纤维化是由多种原因导致的慢性肝损害，肝星形细胞和肌成纤维细胞在损伤区域增生、聚集，合成并分泌平滑肌肌动蛋白及促纤维发生的细胞因子,如转化生长因子(TGF-p1)和生长因子。在中国慢性乙型肝炎是最主要致病原因，在欧美国家慢性酒精性肝炎是肝纤维化的主要原因，若损伤因素长期不能去除，肝纤维化会持续发展，长期慢性刺激导致细胞外基质过度沉积和纤维化瘢痕形成[23]，纤维组织逐渐增多取代原有肝细胞、破坏其正常结构，最终致肝纤维化。Munoz-Luque等[24]用CB2R激动剂JWH133干预CCL4诱导的大鼠肝硬化，可以降低大鼠肝组织单核细胞浸润、肝细胞凋亡、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达、胶原含量和基质金属蛋白酶(MMP)-2的含量，最终减少肝纤维化的发生。结果表明，CB2R激活后抑制炎性反应因子释放，抑制平滑肌细胞增生最终减少肝纤维化的发生。这可能是内源性大麻素通过调控平滑肌细胞增生抑制肺纤维化的发生。

2.5 调控基质金属蛋白酶表达 气道基底膜增厚是气道重构的特征性改变，上皮下基质金属蛋白大量沉积—纤维化，是哮喘气道重构的重要组成部分[25-26]。基质金属蛋白酶(MMP)是一个锌依赖性分泌家族，它们能够降解基质的主要成分，如胶原蛋白、明胶和蛋白多糖。基质金属蛋白酶以潜伏形式分泌后，基质金属蛋白酶原酶被基质金属蛋白水解酶激活，其活性形式与特异性抑制剂基质金属蛋白酶抑制剂(TIMP)相互作用，调节肺癌和急慢性炎性疾病(包括COPD、间质性肺纤维化)的病理生理。在基质金属蛋白酶家族中，基质金属蛋白酶-2、明胶酶A、基质金属蛋白酶-9、明胶酶B对基底膜的重要组成部分Ⅳ型胶原具有切割作用。细胞转化生长因子-β1(TGF-β1)通过调节HTFs中MMPs和TIMP的表达，显著提高纤维粘连蛋白和胶原蛋白的生成。CB2R激动剂HU308和JWH133改善了TGF-β1诱导的纤维连接蛋白、Ⅰ型和Ⅲ型胶原的生成，以及MMP-1和MMP-3的表达，降低细胞外基质的重构、纤维粘连蛋白和Ⅰ型胶原在瘢痕形成中起重要作用[27]。因此，大麻素受体激活后可以调控基质金属蛋白酶表达进而干扰纤维化疾病的发展。

3 内源性大麻素抗肺纤维化的作用

气道炎性反应和气道重构是支气管哮喘2个主要病理学特征[28]。气道平滑肌增厚等病理学表现是哮喘气道重构的一个重要特征，气道重构是肺纤维化的一个重要病变过程，常由于反复慢性炎性反应损伤和修复而引起气道壁结构改变，导致肺功能不可逆转损害，肺纤维化的病理改变主要包括间质纤维化、炎性细胞浸润、上皮细胞增生、胶原纤维增生、平滑肌增生、纤维结缔组织增生[29]。内源性大麻素系统抗心肌纤维化、抗肝纤维化的研究已经得到证实，近年来关于内源性大麻素系统抗肺纤维化的研究逐渐被人们关注，有研究证实[30]，用内源性大麻素干预OVA诱导的过敏性哮喘小鼠可降低小鼠气道阻力，减少气道和肺间隔的胶原含量，减少嗜酸性粒细胞及炎性介质IL-4、IL-5、IL-13、eotaxin的释放，该研究表明，内源性大麻素系统可抑制气道炎性反应，降低气道和肺间隔胶原含量，逆转气道重构延缓肺纤维化的发生。

在百草枯中毒致大鼠急性肺损伤的实验中，用JWH133处理后可以减轻肺组织损伤程度，降低支气管肺泡灌洗液中IL-1β和TNF-α水平，减少肺组织中NF-κB 和AP-1蛋白的表达，从而减轻百草枯所致的肺纤维化。文献报道[17]，用CB2R拮抗剂AM630干预尼古丁诱导的肺纤维化小鼠模型后，小鼠肺泡腔厚度增高，而且肺间质充血，肺结构破坏，Ⅱ型肺泡细胞增生和间质纤维化，该组结缔组织生长因子(CTGF)和α-SMA表达最高，而用JWH133 干预尼古丁诱导的肺纤维化小鼠模型后肺组织结构正常，肺泡间隔最薄。即当CB2R被抑制时肺纤维化程度加重，当CB2R被激活时肺纤维化程度减轻。这一研究表明，内源性大麻素系统中大麻素Ⅱ型受体被激活能降低气道阻力，减少炎性细胞浸润，降低炎性因子释放，抑制气道炎性反应，能减轻肺组织损伤程度，降低气道和肺间隔的胶原含量，抑制结缔组织和新生血管的形成延缓肺纤维化的发生。

一项关于CB2受体激动剂JWH133和抑制剂SR144528对卵蛋白诱导大鼠气道重构影响的实验结果显示，CB2受体激动剂JWH133可以降低卵蛋白诱导的大鼠气道重构肺组织病理损伤，减少肺组织胶原纤维沉积，降低肺泡灌洗液中血管内皮生长因子的表达，降低肺组织基质金属蛋白酶蛋白表达，对卵蛋白诱导的大鼠气道重构有保护作用，CB2受体抑制剂SR144528对卵蛋白诱导的大鼠气道重构没有保护作用。因此，在外周可能主要是大麻素Ⅱ型受体发挥抗纤维化的作用。

4 内源性大麻素抗肺纤维化的调节通路

4.1 磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路 既往研究发现，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路在肺部炎性反应方面起重要作用，该通路是对细胞增殖、分化、调亡及衰老进行调节的关键信号通路之一，Akt在各种纤维化组织中被上调，在炎性分子刺激下，PI3K和Akt磷酸化并被激活，进而通过转录调节细胞的生存、迁移和应激反应。近几年有研究表明，抑制成纤维细胞的PI3K酶可减少TGF-β1诱导的成纤维细胞分化和胶原蛋白的产生。有文献报道用CB2R激动剂JWH133干预肺缺血再灌注损伤的动物模型，可以减轻小鼠肺水肿和肺组织病理学改变，还可以提高肺组织氧合指数(PaO2/FiO2)，降低肺组织炎性因子TNF-α、IL-6的表达，提高过氧化物酶(SOD)的活性，而用CB2R拮抗剂AM630干预后CB2受体被激活保护肺缺血再灌注损伤的作用被阻断，用PI3K抑制剂LY294002干预后CB2R对肺缺血再灌注损伤的保护作用也被阻断，这一研究表明，在不改变CB2R表达的情况下下调p-AKT表达可以阻断CB2R对肺缺血再灌注损伤的保护作用，PI3K/Akt通路可能参与了内源性大麻素系统在减轻肺部炎性反应方面的作用[27]。该通路通过减轻肺部炎性反应，延缓气道重构的发生并达到抗肺纤维化的作用。

内源性大麻素系统能抑制肺巨噬细胞释放血管生长因子(VEGF-A)、淋巴管生长因子(EVGF-C)，研究发现肺巨噬细胞可以产生2-花生四烯醇甘油、N-花生四烯醇乙醇等内源性大麻素，同时巨噬细胞还表达CB1R、CB2R。当予CB1R激动剂ACEA、CB2R激动剂JWH133干预后，脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞释放的VEGF-A、VEGF-C减少，该研究表明在肺巨噬细胞内存在一个完整的内源性大麻素系统，当加用钙螯合剂EGTA后巨噬细胞产生内源性大麻素的效应被抑制，说明内源性大麻素的产生呈钙依赖性。用大麻素受体激动剂干预后巨噬细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)磷酸化上调和活性氧(ROS)生成增加[31]。巨噬细胞是免疫反应和组织重构的关键效应细胞，通过产生广泛的介质，包括血管生成和淋巴管生成因子调节血管和组织重构，在气道重构中，激活肺巨噬细胞的大麻素受体可能是一种新的调节巨噬细胞逆转重构的靶点。

4.2 TGF-β1/Smad3信号通路 TGF-β1是目前发现的促纤维化作用最强的生长因子，其可刺激 PASMCs 发生表型转换并过度分泌细胞外基质，主要成分为Col Ⅰ、Col Ⅲ，引起肺动脉中膜层增厚，从而导致了肺血管重构[32]。Smad3 蛋白是 TGF-β1下游重要的信号分子之一，当 TGF-β1与其配体结合后可介导Smad3 蛋白磷酸化，调控相关基因的转录和翻译，促进胶原蛋白合成。吡非尼酮是FDA目前推荐的治疗特发性肺纤维化的两大药物之一，有显著抗肺纤维化的作用，吡非尼酮能降低血清炎性因子水平，抑制成纤维细胞增殖，显著改善博来霉素诱导的肺纤维化，当予CB2R拮抗剂SR144528进行干预后，吡非尼酮的这种抗纤维化作用减弱，CB2R可能是吡非尼酮抗纤维化作用的靶点[33]。有研究发现，吡非尼酮通过促进Sirt1从而调控TGF-β1/Smad3信号通路来抑制肺纤维化。CB2R在抗肺纤维化中的作用通路可能也包括TGF-β1/Smad3信号通路。经上述2种信号通路的初步研究表明，激活CB2R能抑制巨噬细胞外调节蛋白激酶ERK1/2的磷酸化，能抑制Smad3相关蛋白的表达，提示CB2R在抗肺纤维化中的作用可能与上述2种信号分子介导的调节通路有关。

综上所述，近年来关于内源性大麻素系统在心脏、肝脏、肾脏等组织抗纤维化的研究已经逐渐被人们认识，但是目前国内外关于内源性大麻素系统抗肺纤维化的作用研究还处于动物实验阶段，由于肺纤维化的发生机制复杂，参与因素众多，目前治疗仍然没有突破性的进展,关于内源性大麻素系统抗肺纤维化的研究值得关注，大麻素受体可能是治疗肺纤维化的新靶点，能为进一步认识肺纤维化的发病机制及治疗提供新的方向和证据。