气道上皮细胞损伤修复在哮喘中的研究进展

金明珠，陈晓秋综述 李钰，曹志伟审校

哮喘是一种常见的慢性炎性反应性气道疾病，全世界有超过3亿人患有哮喘，发病率逐年上升[1]。哮喘的经典发病机制建立在气道炎性反应的基础上，过度的气道炎性反应被认为是推动哮喘发生发展的主要病理生理过程。感染、变应原刺激是哮喘发作常见的诱因，哮喘病因非常复杂，是一种多因素疾病[2]。其中一种为“缺陷上皮”假说，即气道上皮细胞损伤修复的缺陷是哮喘的病因之一。事实上，许多损伤因素亦是哮喘发作的诱因，而且哮喘患者气道上皮已被证明有损伤存在，屏障完整性受损[3]。以上皮损伤和修复受损为特征的气道重塑、网状基底膜增厚、气道平滑肌和杯状细胞肥大、增生及血管生成可与气道炎性反应并行发生。有研究认为气道高反应性继发于上皮损伤[4]，这也进一步支持哮喘的缺陷上皮假说。尽管对哮喘的认识有所进展，目前尚无治疗方法能改变疾病的自然病史和进展，关于气道上皮细胞损伤修复的研究或许能对哮喘的治疗开拓新的方向。

1 气道上皮细胞的屏障作用及其损伤修复

气道上皮细胞处于肺内环境与外界环境的交界，是呼吸道抵御外界刺激，如微生物、过敏原等的第一道防线，它维持着肺内各种生物学功能的动态平衡[5]。了解上皮细胞在内环境稳态和疾病病理学中的作用一直是医学研究的热点。

人类气道有多种上皮细胞，根据细胞结构、生化和功能特性，主要分为3种，包括基底立方上皮细胞、柱状纤毛上皮细胞和分泌型气道上皮细胞，它们共同组成假复层黏膜上皮。基底细胞被认为是上皮细胞中的祖细胞，由其分化成分泌细胞和纤毛上皮细胞[6]；传导性气道的大部分上皮细胞是假复层纤毛柱状上皮细胞，来源于基底细胞或分泌上皮细胞，是它们的终末分化阶段[7]。纤毛细胞的特征是其顶端表面多达300个的纤毛结构，细胞内大量的线粒体为纤毛摆动提供能量，这些纤毛以定向的方式，从肺部到喉部清除黏膜上的分泌物及异物；非纤毛上皮细胞，也称为分泌细胞，包括杯状细胞、浆液细胞、棒状细胞及神经内分泌细胞。杯状细胞主要存在于较大的传导性气道中，其特征是分泌黏蛋白颗粒，以捕获气道中的异物。浆液细胞虽与杯状细胞形态相似，但缺乏黏蛋白糖。棒状细胞主要产生表面活性剂和其他蛋白质成分。越来越多的新近证据表明，这些细胞发挥着重要的干细胞作用，即是纤毛细胞和黏液分泌细胞的祖细胞[7]。气道上皮细胞最重要的功能之一是在损伤后以有效和协调的方式驱动上皮修复和恢复屏障的完整性。

作为对损伤的响应，气道上皮必须迅速修复和再生，以恢复其完整性和功能，提供对外部环境的保护屏障及有效的气体交换。细胞损伤修复过程的适当激活是恢复和维持上皮屏障功能的关键，这个过程包括初始炎性反应、细胞的迁移、增殖和分化、炎性反应的分解。这个复杂过程中的任何缺陷都会导致上皮细胞屏障功能的障碍和肺内组织的持续性损伤。伤口边缘的分泌上皮细胞具有去分化能力，而纤毛细胞可以转分化为鳞状细胞以暂时覆盖被剥落的区域。相邻的基底细胞，称为前缘细胞，能够迅速扩散和迁移，使伤口再次上皮化，然后增殖和分化[8-9]。在动物模型中，受损基底膜的再上皮化初始过程主要是细胞迁移。尽管修复的初始阶段同时涉及迁移和增殖，但伤口的大小似乎决定了哪个过程占主导地位。迁移可闭合小的损伤，而并不需要细胞增殖。较大的损伤则需要迁移和增殖共同修复[10]。作为修复过程的重要组成部分，有效的细胞迁移由高度协调的活动组成，它们包括前缘突出、基底黏附、细胞体移位、与基底脱离和后缘收缩。这些修复过程一直持续到气道上皮完全恢复完整屏障功能的假复层黏液纤毛上皮。

2 哮喘与气道上皮细胞的关系

哮喘患者气道上皮的异常一直为人们所熟知，对于支气管上皮的损伤如何导致哮喘患者的支气管高反应性，已有各种理论。人们在哮喘患者的痰液标本中发现存在Creola小体、大量的脱落气道上皮细胞，在支气管活检中也观察到气道上皮细胞的脱落。Creola小体是上皮细胞的碎片，上皮的脱落与碎裂被认为在哮喘发病中起重要作用。还有研究显示，气道的高反应性继发于上皮损伤。上皮细胞功能缺陷是哮喘发生发展的重要因素。

2.1 哮喘患者气道上皮细胞修复功能变化 对于哮喘患者气道上皮细胞的损伤愈合能力，多数研究认为哮喘患者上皮细胞愈合能力明显低于正常人[11]。研究证明，哮喘气道上皮细胞具有较强的增殖能力，增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)mRNA水平升高，但其修复功能失调[12]。另外，哮喘上皮细胞分泌更多的纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1、IL-1β、IL-10及IL-13，这些细胞因子在气道上皮的增殖、分化和修复中起着关键作用[13]。哮喘上皮细胞显示出更为低分化的表型，而且分化出更多的基底细胞和杯状细胞，并有p63表达改变。哮喘患者细胞具有较低的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance，TEER)，细胞间紧密连接减少[14]。表明哮喘患者气道上皮细胞的屏障功能本身就低于正常人。

有学者认为气道上皮是气道炎性反应和重塑的整体调节因子[15]，支气管上皮的损伤可能在哮喘中产生重要的结构和功能影响，导致上皮表型改变，其特点是屏障功能不全、损伤修复不良、感染后缺乏先天免疫应答。有研究显示，反复暴露于屋尘螨过敏原，会使气道发生损伤和重塑[16]。气道的重塑包括基底膜增厚、上皮下纤维化、血管生成增加和平滑肌细胞增生。其特征是上皮细胞增生，黏液分泌细胞数量增加，平滑肌肥大，血管生成增加，辅助型T淋巴细胞(T helper cell type 2, Th2)表型改变。这些特征都类似于人类持续性哮喘的情况。而气道重塑的发生可能继发于上皮损伤，是上皮修复障碍的结果。

2.2 哮喘炎性反应与气道上皮细胞损伤的关系 哮喘患者的气道上皮在损伤发生后，有多种细胞因子释放，其中包括IL-13、IL-25、IL-33、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)等。它们可以激活2型天然淋巴细胞，促进Th2炎性反应[17-18]。但上皮细胞在损伤发生后的细胞因子分泌尚有争议。

有研究发现，不同表型和基因型的哮喘患者对吸入或口服皮质类固醇等抗炎治疗反应各异，其中一些患者不伴有气道嗜酸性粒细胞炎性反应，而以嗜中性粒细胞炎性反应为主[19]。针对此类患者，用抗IL-5单克隆抗体(美波利珠单抗)或T细胞导向疗法(可改善嗜酸性粒细胞炎性反应)治疗后，症状控制不佳[20]。值得注意的是，在没有特应性炎性反应或严重气道炎性反应的情况下，结构改变本身也与哮喘患者呼吸道症状和气道生理功能异常有关[21]。以上皮损伤和修复受损为特征的气道重塑、网状基底膜增厚、气道平滑肌和杯状细胞肥大、增生和血管生成不一定是继发于气道炎性反应，而可能与气道炎性反应并行发生。因此，哮喘患者潜在的上皮功能缺陷可能使其气道易于发生损伤、炎性反应、气道重塑及哮喘症状的持续。

2.3 哮喘Th2型炎性反应与气道上皮细胞损伤修复 哮喘患者气道上皮细胞较正常人损伤修复能力差，目前已有多项关于Th2型炎性反应的研究[22]，但对于Th2型炎性反应中各种重要的细胞因子对上皮细胞损伤修复的作用，尚有争议[23]。人们通过小鼠模型描述了Th1、Th2型炎性反应在免疫应答中的作用。结果显示，在过敏性哮喘模型中，炎性反应以Th2型反应为主[17]。用皮质类固醇及靶向Th2通路组分的分子，如抗IgE、IL-4和IL-13治疗，证实了Th2型炎性反应与过敏性哮喘之间的关系[18]。

在Th2型炎性反应与上皮细胞损伤修复关系的实验中，IL-13颇受关注。已知IL-13能上调与气道上皮重塑相关蛋白的表达，其中包括periostin和表面蛋白D[24]。虽然IL-13会参与一系列与哮喘相关的炎性反应，但对上皮细胞屏障功能的作用尚存在矛盾。有学者认为IL-13对损伤修复起促进作用，也有实验显示IL-13会破坏上皮细胞的屏障功能，并降低细胞损伤修复能力[23，25]。还有研究认为，IL-13似乎具有双重作用：低水平的IL-13将有利于BEC迁移和伤口愈合，而高水平IL-13可能降低细胞损伤修复[26]。

3 哮喘患者气道上皮细胞损伤修复的模型研究

许多体外和体内模型已被开发用于研究慢性气道疾病，拓宽对生理和病理状态的理解，以及发现新的治疗药物。然而，体内动物模型往往由于缺乏人体疾病如哮喘的解剖学或遗传学基础，并有显著的种间差异，而难以与人类生物学联系起来。例如动物模型缺乏人肺呼吸细支气管中基底细胞的单纯立方体上皮[27]。在小鼠中，含有基底祖细胞的假复层上皮主要局限于小鼠气管，而在主支气管中没有基底细胞向柱状上皮的过渡[27]。在人类哮喘的情况下，由于疾病的异质性和对疾病发病机制的有限知识，研究气道疾病中主要细胞类型的复杂相互作用十分困难，确定它们在发病和疾病发展中的作用颇具挑战，而目前尚没有完整的人类患者替代模型。鉴于实验过程中无法在人体支气管内行任何形式的损伤，为了克服种间差异，明确细胞对损伤的特异性反应，上皮细胞培养模型已被广泛使用。这些培养方式下的损伤修复模型对损伤修复过程的理解具有重要影响。

3.1 气道上皮单层细胞培养损伤修复模型 目前主要的细胞培养方式是单层细胞培养，即常规培养皿培养[28]。使用细胞培养单层损伤试验有诸多优点，如这种培养方式相对简单易行；细胞选择多样，既可以选择细胞系，亦可选择原代上皮细胞；连续动态观察细胞在损伤修复不同时段的表现。人们利用这种培养方式获得了许多气道上皮损伤修复的信息。

通过上皮细胞的单层培养损伤修复模型，人们发现哮喘上皮细胞存在损伤修复缺陷，即上皮缺陷假说，上皮的这种缺陷会在哮喘的发生发展中起重要作用[29]。多项实验证实，损伤后的上皮细胞中，多种炎性细胞因子、尤其是Th2相关细胞因子表达异常，说明上皮细胞的损伤会引起一系列哮喘相关炎性反应，而这些炎性反应也被认为是哮喘的重要驱动因素。在这个模型中，人们还发现，Th2相关细胞因子会对细胞损伤修复产生影响。关于这种影响，学界还存在许多争议，用Th2相关细胞因子在不同浓度和不同时段刺激上皮细胞，会对损伤修复产生促进、抑制、甚至是浓度依赖的双重作用。Th1相关细胞因子对损伤修复的影响则与Th2相关细胞因子相反[4]。单层培养损伤修复模型为研究上皮细胞损伤修复与哮喘之间的关系提供了可能，随着研究的深入，人们对哮喘的发生发展有了更进一步的了解，这一问题仍是现今的研究热点。

另外，通过单层细胞培养，人们发现上皮细胞的扩散和迁移依赖于纤维连接蛋白及整合素介导的细胞间相互作用。还有研究使用支气管上皮细胞系(1HAEo-)体外模型发现，在正常损伤修复过程中，mRNA的表达在不同时间点受到不同调节[23]。但这些研究也显示，细胞系和原代细胞培养在损伤修复时间上的差异，1HAEo-细胞系在24 h内愈合，而相同条件下，原代细胞培养至少需要48 h才能愈合[30]。

3.2 气道上皮细胞气液平面培养损伤修复模型 单层细胞培养解决了许多关于哮喘患者气道上皮细胞损伤修复的问题，但人体内的支气管上皮细胞时刻暴露在空气中，与空气只相隔细胞表面的黏液毯。而单层细胞培养过程中，上皮细胞浸泡于培养基中，与空气没有接触，细胞没有明显极性，与体内细胞有很大区别。常规的培养皿无法做到既提供细胞所需的养分，又保证细胞接触外界空气。如果要研究哮喘患者气道上皮的真实状态，就需要开发更接近人体内状态的损伤修复模型。借助肿瘤侵袭研究中常用的transwell小室培养板，人们研发出了气液平面(air-liquid interface, ALI) 培养方式[31]。在transwell培养板的下层放置培养基，细胞培养于上层transwell小室的半透膜上，培养基可以通过transwell小室的半透膜达到细胞下部，这样既保证细胞所需养分，又能使细胞上表面暴露于空气，细胞自身分泌的黏液分布于细胞与空气之间，形成类似于人体内支气管上皮细胞上的黏液毯。

通过此模型，人们发现哮喘患者分化良好的上皮细胞与单层细胞不同。ALI细胞培养模式会在很大程度上模拟人体内情况，培养的细胞会处于极化状态，多数实验通常选择培养4周左右的时间，细胞的上层会分化出纤毛[10-11，32]。Wenzel实验室发现，支气管上皮细胞培养至第7天即呈现极化状态，细胞表面出现纤毛，细胞呈现复层生长，这也大大缩短了观察时间，提高了实验效率[33]。而且研究也发现，ALI培养状态下细胞间连接形成[32]，以此研究细胞间相互作用对损伤修复的影响。

但ALI培养也有其局限性，在ALI培养状态下，除去培养皿底，光线还需穿过小室半透膜、底层培养基才能达到物镜，即倒置显微镜很难观察到细胞。小室的上部框架使得正置显微镜的物镜也无法贴近细胞。如何更好地利用ALI培养方式观察细胞损伤修复过程有待进一步研究。

3.3 气道上皮损伤修复研究的其他模型 技术的进步和跨学科研究带来了更多创新的模型开发。鼻息肉组织原代上皮二维培养被用于气道创伤修复的细胞力学研究，人们还开发出原位支气管黏膜组织的机械损伤模型和三维体外/硅创伤修复模型[34-35]。其中肺泡上皮创伤修复的硅胶模型可以模拟细胞培养的损伤修复模式[36]。另外，体外上皮损伤修复的数学模型也为创伤修复和细胞生物学领域提供了新的机会和工具。

4 小 结

综上，有效的气道上皮损伤修复对维持气道环境稳态至关重要。细胞损伤修复过程的不同是在健康气道上皮和哮喘气道上皮的重要差别。各种创新的模型正在更加深入地研究气道上皮损伤修复与哮喘发生发展的关系，为哮喘的治疗寻找新的靶点。