糖酵解关键酶在宫颈癌Warburg效应中的作用研究进展

范佳杨，梁 婷综述，刘 康，罗岳西审校

0 引 言

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内其发病率仅次于乳腺癌，死亡率位居全球第二[1]。全世界每年大约有50万名妇女被诊断出宫颈癌，且发病人群呈年轻化趋势，严重威胁着女性的生命健康。Warburg效应作为肿瘤细胞代谢特征之一，发现至今已近百年，在近10余年被广泛研究，被大量研究深入探讨。目前关于肿瘤细胞中普遍存在Warburg效应的解释有多种，其中一个热点集中在糖酵解通路中的一些关键酶上，如烯醇化酶(Enolase)、磷酸甘油酸变位酶(phosphoglycerate mutase, PGAM)、己糖激酶(Hexokinase, HK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PK)等。研究表明，在肿瘤组织和细胞中，这些关键酶的表达和活性发生了改变[2-5]。因此，许多参与糖酵解的关键酶有望成为宫颈癌治疗的靶点，为进一步研究宫颈癌发生、发展机制提供新思路。本文主要就与宫颈癌Warburg效应相关的酶作一综述。

1 Warburg效应

葡萄糖是一种重要的营养物质，糖代谢对于维持动物的生命活动至关重要。细胞的能量主要来源于糖代谢，糖代谢有两种途径，氧化磷酸化和糖酵解。正常细胞在有氧条件下糖酵解被抑制，主要利用的是有氧呼吸。20世纪20年代，德国生物化学家Otto Heineieh Warburg研究发现，肿瘤细胞与正常细胞的糖代谢存在很大的不同，在恶性增殖过程中，能量代谢途径发生了改变，癌变细胞的能量代谢途径由三羧酸循环为主转变为糖酵解为主。Warburg指出在氧气供应充足的情况下，肿瘤细胞仍然偏好以糖酵解来获取能量，而不是供能效率更高的氧化磷酸化，这一现象被称之为Warburg效应[6]。Warburg效应被认为是肿瘤细胞为了适应增殖分化的能量需要所发生的代谢重构，该效应为肿瘤细胞的生长、增殖提供大量的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)，并且制造了适宜肿瘤细胞生存的微环境，增强了其侵袭和转移能力，也帮助肿瘤细胞逃避机体免疫和细胞凋亡机制。

据报道，糖酵解酶转录的上调与肿瘤的发生密切相关[7-9]。同时也有研究发现，许多糖酵解基因Warburg效应联系在一起，为糖代谢在肿瘤发生中的作用提供了进一步的证据[10]。因此通过利用糖酵解过程的代谢特点，筛选出一些糖酵解相关的酶，特异地抑制肿瘤细胞的Warburg效应，将有效地抑制肿瘤的侵袭和增殖，为肿瘤的治疗提供新的途径。

2 与Warburg效应相关的酶

2.1 EnolaseEnolase是一种金属酶[11]，是糖酵解过程中的关键酶之一，有三种不同形式的烯醇化酶，即ENO1、ENO2和ENO3[12]。ENO1在许多肿瘤中的转录活性和蛋白表达量均上调[3]。ENO1在细胞的分布位置和表现的功能不同，在肿瘤细胞表面可以观察到ENO1，如乳腺癌、肺癌和胰腺癌细胞[13-15]。在细胞表面，ENO1与纤溶酶原结合，纤溶酶原和纤溶酶的细胞外蛋白水解活性在癌细胞增殖、侵袭和转移中起重要作用。在细胞核表达的ENO1与MYC结合(MYC为编码基本核转录因子的调节基因和原癌基因家族，属于碱性螺旋环螺旋DNA结合蛋白超家族，主要调控细胞生长、增殖、分化、细胞周期、代谢、存活、凋亡以及肿瘤发生[16]，抑制环氧合酶COX2的表达，从而抑制肿瘤细胞的上皮间质化[17]，但 ENO1 对肿瘤细胞促进增殖的作用并未在正常细胞中观察到[18]。烯醇化酶能够催化2-磷酸甘油酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸[19]。张栋栋等[20]通过western blot法验证了通过慢病毒建立的沉默ENO1基因的细胞的ENO1表达量明显低于正常细胞。采用MTT法检测出沉默ENO1基因后的宫颈癌Siha细胞增殖能力减弱，并且对化疗药物的敏感性增强。Michela 等[12]通过研究胰腺癌及乳腺癌细胞发现可通过沉默ENO1来抑制糖酵解和促进氧化磷酸化这两方面来影响肿瘤细胞的Warburg效应。沉默ENO1后，细胞中的磷酸果糖激酶表达下调，这将严重影响葡萄糖进入糖酵解过程。由于糖酵解通量受损，沉默ENO1后乳酸水平下降。沉默ENO1后的细胞还表现出谷氨酰胺酶的活性增加，谷氨酰胺代谢物在三羧酸循环中被迅速消耗，所有细胞系均观察到线粒体链电子通量的上调，特别是通过复合物Ⅰ和Ⅱ，同时增加了耗氧量，ATP的合成量也有了很大程度的增加。ENO1沉默的细胞倾向于消耗更多的O2维持氧化磷酸化[7]。由此可见，ENO1在肿瘤细胞中普遍呈高表达，ENO1将会是宫颈癌治疗中一个非常有前景的和临床相关的靶点。

2.2 PGAMPGAM是最初在脑组织中发现的PGAM家族成员，包含PGAM1和PGAM2两个同源二聚体[21]。定位于人染色体10q25.3区域，编码cDNA全长1709 bp，包括一个31-bp 5′非翻译区(5′UTR)、一个765 bp编码区和一个913-bp 3′非翻译区(3′UTR)，延伸至Polya尾。既往有研究已证实PGAM1是参与细胞有氧糖酵解途径的关键酶之一，PGAM 1通过协调糖酵解戊糖磷酸途径来支持癌细胞快速增殖，这与其控制细胞内3-磷酸甘油和2-磷酸甘油的代谢功能有关[4]。傅柳桃等[2]采用免疫组化法检测了67例宫颈癌和癌旁组织中PGAM1的表达水平，结果显示宫颈癌组织中PGAM1表达明显高于癌旁组织。同时运用MTT法、流式细胞术、荧光定量实时PCR和Western blot法，检测宫颈癌Hela细胞的周期、凋亡以及增殖情况，初步证实了PGAM1是通过激活Akt/mTOR信号通路来诱导、调控 Warburg效应，促进肿瘤细胞的增殖。MTT结果表明，宫颈癌Hela细胞PGAMl基因沉默后，肿瘤细胞增殖活性明显受到抑制，细胞凋亡率显著增加，葡萄糖消耗和乳酸产量明显降低，PTEN表达量明显上调，PTEN是Akt/mTOR信号通路的负性调控蛋白，具有抑制癌基因的活性，可抑制肿瘤细胞增殖，并促使肿瘤细胞凋亡[2]。由此可见，PGAM1在宫颈癌组织中表现为上调，且可作为宫颈癌诊治的标志物。

2.3 HKHK是葡萄糖代谢过程中的第一个限速酶，催化葡萄糖生成6-磷酸-葡萄糖(G-6-P)，作为ATP生产和代谢物生物合成的底物[22-23]。HK有四种亚型：HK-Ⅰ，HK-Ⅱ，HK-Ⅲ，HK-Ⅳ。HK1主要与线粒体结合，主要参与ATP生成的分解代谢，而HK2主要位于细胞质内，主要参与代谢物的合成[24-25]。在免疫组织化学分析中，正常宫颈组织几乎无HK2信号，而约60%的宫颈癌标本HK2染色呈阳性[26]。Tseng[4]等采用Western blotting和免疫荧光染色法分析了HK1和HK2在多种癌细胞中的表达。人宫颈癌(HeLa和SIHA)、乳腺癌(MCF 7)和前列腺癌(PC3)细胞表达大量HK1和HK2，HK1主要分布于胞浆和线粒体，而HK2主要分布在胞浆中，HK1和HK2在能量代谢中均起着重要作用[27-32]。在HK1沉默的细胞中磷酸化AMP依赖蛋白激酶(p-AMPK)水平和p-p38 MAPK蛋白水平均升高，干扰了生物能量的稳态，导致AMPK/p38MAPK通路的扩增，从而改变了细胞的能量代谢，HK1沉默可导致线粒体呼吸出现严重缺陷，但增加葡萄糖摄取，促进糖酵解活性。HK2的高表达导致p53/Tigar和SCO2通路增加糖酵解代谢。由此可见，HK在宫颈癌组织中呈现高表达，研究HK在糖酵解途径中的机制也将成为肿瘤治疗的靶点。

2.4 PK丙酮酸激酶M2 (pyruvate kinase M2，PKM2)是糖酵解中的关键酶之一，广泛存在于多种恶性肿瘤中。Lin等[5]等通过qRT-PCR检测到PKM 2在宫颈癌组织和细胞中均有高表达。已有研究表明PKM2可作为转录辅激活物发挥作用，PKM 2一旦进入细胞核，可促进靶基因的转录，如HIF-1α靶向表达的谷蛋白、PKM 2、LDH-A和VEGF-A，从而促进癌细胞的生长、正反馈调节的糖酵解[33]。细胞膜表面的表皮生长因子受体激活后的PKM2依赖的正反馈环促进有氧糖酵解，以及上调葡萄糖转运蛋白(glucose transporter1，GLUT1)和乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDHA)的表达[34]。原癌基因Myc家族在癌症中经常被过度激活，并通过增加许多糖酵解酶的表达与HIF在肿瘤代谢中发挥重要的协同作用[35-36]。MYC转录后，GLUT 1、LDHA和PTB介导的PKM 2表达上调。这些限速糖酵解基因的高表达在表皮生长因子诱导的Warburg效应中起着关键作用，其特点是葡萄糖摄取增加，氧气作用下乳酸生成增加，从而促进肿瘤的发生。由此可见，PKM2在宫颈癌组织中呈现高表达，为人类肿瘤治疗提供了新的靶点。

2.5 LDH乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)也是糖代谢通路中的重要限速酶。LDH的分子量大约为140KD。一般认为，LDH可分为LDH-A和LDH-B两种[37]。转录因子HIF-I和Myc在转录和或翻译水平调节LDH-A基因的表达水平。c-Myc促进线粒体谷氨酰胺代谢，导致进入三羧酸循环的碳减少，并降低线粒体对糖脂生物合成的能量供应。在结直肠癌的研究中，转录因子c-myc具有使糖酵解代谢相关基因表达增加和促进LDH-A参与线粒体生物合成的作用[38]。LDH-A对肿瘤的微环境和肿瘤的进展、转移重要的影响，高表达的LDH-A与肿瘤预后不良有关[39]。在肿瘤组织中高表达的LDH-A积极地将丙酮酸还原为乳酸支持癌细胞的增殖。LDH-A活性的增加也会增加乳酸的生成，从而导致乳酸在细胞外环境中的输出。从恶性细胞中扩散出来的代谢物刺激周围成纤维细胞合成透明质酸，导致细胞外基质的重新排列，促进侵袭性细胞的生长[40]。LDH-B的表达下降与DNA的甲基化密切相关。Brown等[41]证实在人类乳腺癌中，LDH-B亚单位的表达丧失可能发生在早期，其潜在机制可能与LDH-B启动子甲基化有关。此外，由于LDH-B缺乏细胞在缺氧条件下表现出明显的乳酸水平升高，因此LDH-B表达的减少可能为癌细胞的生长提供了有利条件。由此可见，研究LDH在糖酵解途径中的机制也将成为肿瘤治疗的靶点。

3 结 语

宫颈癌的发生、发展是一个复杂的生理过程，宫颈癌的侵袭、转移过程又极其复杂，这为早期发现、干预和治疗宫颈癌带来许多困难。Warburg效应是公认的肿瘤细胞的代谢特征之一，肿瘤性糖酵解增加糖代谢，产生乳酸，从而产生酸性和低氧的微环境，促进肿瘤的发生、侵袭和转移，这与临床和预后密切相关，为肿瘤的预防和治疗提供了非常重要的理论基础和研究方向。Warburg效应及其在癌细胞中作用的广泛研究，提高了对肿瘤细胞增殖原因的认识，但其影响宫颈癌的发展及预后仍然有一些机制不甚明确。虽然现在针对Warburg效应仍然有许多亟待解决的问题，但随着科学研究的不断深入，通过干预糖酵解的关键酶来干扰肿瘤细胞的Warburg效应来切断其能量生成来干预宫颈癌的发生、发展将逐渐成为现实，为临床上的治疗提供新的思路，为越来越多的宫颈癌患者带来希望。