胆固醇对人视网膜色素上皮细胞钙转运通道表达的影响

张敏，张朔，张鹏，赵洪礼

(1.沈阳大学生命科学与工程学院城市有害生物治理与生态安全辽宁省重点实验室，沈阳 110044；2.沈阳百发科技有限公司，沈阳 110163；3.辽宁何氏医学院基础医学院，沈阳 110163)

玻璃膜疣是黄斑老龄化的共同特征，是其最早期的眼底表现，是年龄相关性黄斑变性(agerelated macular degeneration，AMD)的重要危险因子，与AMD的进展密切相关[1]。如果玻璃膜疣的形成能够被调整的话，AMD的发展进程可能延缓或者停止。已有研究[2-4]表明玻璃膜疣形成起始阶段为在视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)下层微小羟基磷灰石球粒(不溶性碱性磷酸钙)以含胆固醇的脂滴为核心沉积，而其外层被Aβ、玻连蛋白、补体因子H等蛋白质包被覆盖。其中玻璃膜疣形成的起始成分为胆固醇，钙元素在RPE下的积累特别是不溶性钙的沉积加速了玻璃膜疣的形成进程。同时在细胞内钙离子广泛参与细胞信号转导，如果大量的钙离子内流引发钙超载可造成细胞的损伤及凋亡[5-6]。本研究以细胞膜钙ATP 酶1(plasma membrane Ca2+ATPase 1，PMCA1)、L型电压依赖性钙离子通道(L-type voltage-dependent calcium channel，LVDCC)和细胞膜钠钙交换蛋白1(sodium calcium exchange protein 1，NCX1)三个钙转运通道为代表，利用胆固醇培养人RPE细胞，分析RPE细胞钙转运相关通道蛋白表达水平上的变化，初步了解玻璃膜疣形成起始阶段与RPE细胞钙转运状态的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

ARPE-19细胞株购买自北纳生物(细胞系，中国)；胆固醇(≥99%)购自美国Sigma公司；RIPA lysis buffer和BCA蛋白定量检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；PMCA1抗体购自于英国Abcam公司，NCX1和LVDCC抗体购自于美国Proteintech公司；荧光染料购自瑞士Roche公司的light cycler 480 SYBR Green I Master。

1.2 体外培养ARPE-19

将ARPE-19细胞株解冻离心后接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中，置于37 ℃、体积分数为5% CO2培养箱中培养。生长至大部分细胞接近融合状态时使用0.25%胰蛋白酶消化传代。继代培养3～5代细胞用于后续实验。

1.3 胆固醇处理ARPE-19 细胞

设置正常培养对照组和胆固醇处理组。具体方法见文献[7]，对照组按上述体外培养ARPE-19 的方法正常培养。血液中的胆固醇浓度约为2 mg/mL。选择以略高于血液中胆固醇的浓度培养，给予细胞一种类似于胆固醇在胞外略有积累的环境。正常培养条件下和胆固醇浓度2.5 mg/mL培养条件下分别取培养0、6、12、24、48、72 h不同时间的ARPE-19细胞样品，液氮速冻后-80 ℃保存用于后续检测。不同处理组光学显微镜下观察取图，记录好培养过程中细胞变化。

1.4 实时定量PCR 检测钙转运相关蛋白RNA 水平的变化

吸去细胞原培养液，PBS 清洗一次，用胰酶消化细胞，1000 r/min离心5 min，PBS重悬细胞，1000 r/min 离心5 min，弃上清。采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit进行R N A 提取，以g DNA Era ser 与R N A溶液混合在42 ℃共浴2 min去除基因组DNA，之后反转录试剂盒反转录获得mRNA。采用荧光定量PCR(quantitative real time-PCR，qRT-PCR)技术检测mRNA转录表达水平变化，以Tubulin为内参，利用Roche light cycler 480 SYBR Green I荧光染料反应、循环数Ct 值法在ABI荧光实时定量PCR仪上检测分析。反应程序为：95 ℃ 10 min，30 cycles(95 ℃ 10 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s)，65～95 ℃ 0.5℃/5 s。LVDCC退火温度为60 ℃。内参Tubulin和3个钙转运通道基因引物见表1。统计学软件为Excel 17.0，利用方差分析进行显著性检验，分别比较2个组不同处理时间与0 h时的表达变化。

1.5 蛋白质印迹法检测

以R I PA蛋白裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白，以BCA试剂盒检测蛋白浓度。12%凝胶浓度进行SDS-PAGE电泳分离蛋白质，电转PVDF模后一抗和二抗孵育，蛋白质印迹法检测不同处理下的蛋白表达量变化。凝胶系统观察取图，以Tubulin蛋白为标准参照，用Image J软件对图片结果进行灰度扫描分析。

2 结果

2.1 胆固醇对RPE 细胞PMCA1、LVDCC 和CX1 转录水平表达的影响

通过实时定量PCR 检测正常培养对照组和2.5 mg/mL胆固醇暴露处理0、6、12、24、48、72 h各时间段ARPE-19细胞中PMCA1、LVDCC和NCX1 mRNA表达的情况。结果表明：在正常培养条件下，随着时间延长，PMCA1 mRNA表达略有升高，在72 h时有显著升高。而胆固醇暴露的ARPE-19细胞中PMCA1 mRNA表达水平明显低于对照组，从6 h开始到72 h PMCA1 mRNA表达显著下调，在12 h表达水平最低，下调了约2倍，但未呈现时间依赖性(图1A)。在正常培养条件下LVDCC mRNA表达也在72 h显著升高；与对照组相比，胆固醇处理组长时间培养(24 h和48 h)LVDCC mRNA 表达明显上调，24 h时表达上调了近4倍，差异具有统计学意义(P<0.05，图1 B)。在正常培养条件下NCX1m RNA 表达水平随时间延长无明显变化，而胆固醇处理后NCX1 mRNA表达水平明显高于对照组，特别是在24 h，表达上调了近6倍(图1C)。在胆固醇处理组72 h时LVDCC 和NCX1 mRNA表达水平与处理24 h、48 h相比显著下调，都是在处理时间超过24 h后表达出现回落，表现出一定的时间效应。这些结果表明：胆固醇处理下PMCA1转录水平表达显著降低，LVDCC 和NCX1 转录水平表达上调。

图1 胆固醇处理对PMCA1(A)、LVDCC(B)、NCX1(C)三个基因mRNA表达水平的影响Figure 1 The effect of cholesterol treatment on the mRNA expression levels of the three genes PMCA1 (A),LVDCC (B) and NCX1 (C)

2.2 胆固醇对RPE 细胞PMCA1、LVDCC 和NCX1蛋白质表达水平的影响

通过蛋白质印迹法检测正常培养和2.5 mg/mL胆固醇处理0、6、12、24、48、72 h各时间段ARPE-19细胞中PMCA1、LVDCC和NCX1的蛋白质表达的情况(图2)。结果表明：胆固醇处理24 h后PMCA1蛋白质含量明显降低，特别是 72 h。胆固醇处理组的LVDCC和NCX1的蛋白质表达明显增多，在48 h增加最明显。

图2 蛋白质印迹法检测胆固醇处理对PMCA1、LVDCC、NCX1蛋白质表达水平的影响Figure 2 Western blot detection of the effect of cholesterol treatment on the protein expression levels of PMCA1,LVDCC and NCX1

为定量比较两组蛋白表达的变化，对蛋白质印迹法结果进行了灰度分析(图3)。加入胆固醇培养的ARPE-19细胞中PMCA1蛋白质含量随时间延长不断降低，最低在72 h，降低了约2倍(图3A)。胆固醇处理组在48 h LVDCC蛋白质表达水平最高，增高了约4倍(图3B)，NCX1蛋白质含量在胆固醇暴露48 h增加约1.7倍(图3C)；两个蛋白质的表达均是在72 h 略低于48 h。这些结果表明：胆固醇处理下PMCA1蛋白质表达明显减少，LV D CC 和NC X 1 的蛋白质表达水平上调。

图3 蛋白质印迹法检测的灰度分析结果Figure 3 Gray analysis results of western blotting detection

3 讨论

玻璃膜疣位于RPE层及Br uch膜之间，是由RPE细胞残片、炎性因子、补体因子及补体激活物、脂褐素等堆积而成的细胞外沉积[1,7-8]。玻璃膜疣的出现与危害视力的黄斑病变，如视网膜色素上皮脱离、萎缩和脉络膜新生血管的发生密切相关[9]。已有研究在实验室培养过程中重建了仅依赖于RPE细胞的玻璃膜疣生物发生过程，表明RPE细胞可能是细胞外玻璃膜疣形成的起始和调控的关键位置[3-4]。RPE细胞具有转运视色素、转运营养成分和清除自由基等功能，RPE细胞功能正常对维持视网膜的功能和结构有重要意义。所以RPE功能异常可能既是玻璃膜疣形成的主要因素，也可能是玻璃膜疣形成后对RPE的影响结果，包括RPE细胞钙离子转运等功能。作为重要的第二信使，细胞内钙离子参与调控细胞的增殖、分化、自噬和凋亡等过程，对于细胞活力的维持至关重要[6]。钙离子稳态失衡可能会引起RPE细胞功能障碍和细胞凋亡，而RPE细胞渐进性功能障碍或凋亡在AMD的发病进程中起至关重要的作用，RPE细胞凋亡也是干性AMD早期病理改变之一[5,9-10]。起始阶段以胆固醇为核心的脂滴在细胞外不溶性钙的存在下加速滞留蛋白质，形成聚合体沉淀可能是玻璃膜疣形成的一种机制[2]。综上所述，RPE细胞钙离子稳态可能与玻璃膜疣形成关系密切，存在互相影响。

本研究以玻璃膜疣形成起始阶段主要成分胆固醇作用于RPE细胞。通过检测三个钙离子相关转运通道转录水平和蛋白质表达水平的变化，发现胆固醇使PMCA1表达减少，LVDCC和NCX1表达上调，且LVDCC表达上调倍数最大。其中PMCA1为细胞膜上将细胞内高浓度的钙离子转运至细胞外的钙泵，而通过LVDCC进入细胞是细胞外钙离子进入RPE细胞的主要方式，NCX1作为调控细胞内外钙离子稳态重要的跨膜转运蛋白，也是细胞内钙变化的关键钙通道[11-13]。LVDCC在胆固醇处理下明显上调，可能促进细胞外钙离子进入细胞。而PMCA1和NCX1的下调，则有可能引起细胞内钙离子外排受阻。所以胆固醇暴露可能使RPE细胞的钙离子外排受到抑制，引进钙离子内流。胆固醇处理下NCX1和LVDCC的转录水平表达在24 h最高，之后48 h和7 h出现回落；其蛋白质水平表达在胆固醇处理48 h最多，在72 h略有降低，比转录水平表达增多的时间上略有延迟。这可能受处理时间延长导致死亡细胞增多的影响。玻璃膜疣形成起始阶段脂质积累的刺激，可能引起RPE细胞钙超载，从而导致细胞的凋亡。而死亡RPE细胞的碎片及钙离子的释放可能会继续促进玻璃膜疣聚合体的形成。本研究探讨了胆固醇对RPE细胞钙离子转运通道的影响，但胆固醇对RPE细胞凋亡的影响及此影响是否参与玻璃膜疣的形成过程尚需进一步探讨。

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