高效液相色谱法测定穿梅三黄散中黄芩苷的含量

方忠意，刘素梅，刘占通，邱天宝，韩 立，王军红

（河南省兽药饲料监察所，河南 郑州 450008）

穿梅三黄散收载于《中国兽药典》2020年版二部中，是由大黄、黄芩、黄柏、穿心莲、乌梅五味药材经粉碎、过筛和混匀制备而成的中兽药散剂，主要用于治疗水产动物细菌性败血症、肠炎、烂鳃与赤皮病［1-2］。黄芩苷属黄酮类化合物，对多种病毒、真菌、细菌具有抑制作用［3-5］，常用其含量作为评价黄芩及其制剂质量的一种手段。目前，《中国兽药典》中穿梅三黄散的质量标准只有显微和薄层鉴别检验，缺少含量测定的方法和指标。该研究参考了部分文献［6-7］，建立了黄芩苷含量测定的高效液相色谱法，可以更加精准地评价穿梅三黄散质量，为兽药生产企业加强产品质量控制提供了参考手段。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

1.1.1 仪器设备

Waters高效液相色谱系统：包含2695分析系统、2487紫外检测器、Empower2色谱工作站；MILIPORE超纯水处理器；METTLERXP205电子天平。

1.1.2 试药试剂

黄芩苷对照品来自中国兽医药品监察所，批号为Z01271705，含量以96.8%计；穿梅三黄散样品为实验室自制（大黄25g、黄芩15g、黄柏5g、穿心莲2.5g、乌梅2.5g，粉碎，过筛，混匀即得）；穿梅三黄散阴性对照样品为实验室自制（大黄25g、黄柏15g、穿心莲2.5g、乌梅2.5g，粉碎，过筛，混匀即得）；乙腈、甲醇为色谱纯试剂，试验中使用的水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法与结果

1.2.1 色谱条件的选择

参考相关有关文献，通过比较不同色谱洗脱条件，以样品中黄芩苷色谱峰的峰形是否对称、有无杂质干扰为原则，确定色谱条件为：XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色谱柱，柱温为30℃，流动相为乙腈-0.2%磷酸（22∶78），检测波长为278nm，进样量为10μl。

1.2.2 样品溶液的制备

1.2.2.1 供试品溶液的制备 精密称取样品0.15g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超声处理30min，放至室温，加70%乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜即得。

1.2.2.2 阴性对照样品溶液的制备 精密称取阴性对照样品0.11g，置100ml容量瓶中，加70%乙醇至近刻度，超声处理30min，放至室温，加70%乙醇稀释至刻度，混匀，过0.45μm微孔滤膜即得。

1.2.2.3 提取方法的考察 精密称取穿梅三黄散供试品0.15g，共8份，置于100ml量瓶中，加70%甲醇溶液至刻度，分别超声10、20、30、40min，每种超声时间做2份平行，提取液分别进样。通过比较穿梅三黄散供试品中黄芩苷的含量，考察不同时间提取效果。结果表明，不同超声时间提取效果差别不大，但还是以超声提取30min提取效果最好。

1.2.3 线性关系考察

精密称定黄芩苷对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为黄芩苷对照品贮备液；分别精密量取黄芩苷对照品贮备液适量，加70%乙醇，配制成浓度为2、4、10、20、50、100μg/ml的系列对照品溶液，经0.45μm微孔滤膜过滤后进高效液相色谱仪。记录色谱图，以对照品溶液浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程和相关系数，结果见图1。

图1 黄芩苷标准曲线图

1.2.4 准确度试验

精密称取6份穿梅三黄散阴性对照样品0.11g，分别精密加入6mg黄芩苷对照品，按1.2.2.1项下供试品溶液制备方法进行处理，按1.2.1项下色谱条件进行进样，按外标法以峰面积计算黄芩苷含量及RSD，结果见表1。

表1 准确度试验结果

由表1可见，该方法准确性好，可以很好地对黄芩苷进行定量测定。

1.2.5 精密度试验

取同一批样品，共6份，按照1.2.2.1项下供试品溶液制备方法进行处理，按照1.2.1项下色谱条件进行进样，按外标法以峰面积计算黄芩苷含量及RSD，结果见表2。

表2 精密度试验结果

1.2.6 耐用性试验

采用XBridgeC18（5μm，4.6mm×150mm）色谱柱，柱温为30℃，取同一份供试品溶液，分别用乙腈-0.2%磷酸（76∶24）、乙腈-0.2%磷酸（78∶22）、乙腈-0.2%磷酸（80∶20）为流动相进行采样，得到不同比例条件下的色谱图。在3个不同比例的流动相条件下，黄芩苷的色谱峰均能与杂质峰完全分离，满足不同的需求。

1.2.7 专属性试验

取阴性对照样品0.11g，按1.2.2.2项下供试品溶液制备方法进行处理，之后按照1.2.1项下色谱条件进行进样，记录色谱图，结果见图2至图5。

图2 黄芩苷对照品色谱图

图3 阴?性对照样品色谱图

图4 阴性对照样品添加黄芩苷色谱图

图5 穿梅三黄散供试品色谱图

由图可知，在选定的色谱条件下，黄芩苷色谱峰峰形尖锐、对称，且在对照品色谱峰的相应位置上阴性对照样品无色谱峰，说明供试品溶液中无其他成分对黄芩苷的测定造成干扰，方法专属性良好。

3 结论与讨论

该试验研究建立了测定穿梅三黄散中的黄芩苷含量的高效液相色谱法，提取方法简便、回收率高、定量准确，可以用于穿梅三黄散中黄芩苷含量的精准测定。

该试验中采用70%乙醇并结合超声波提取的方法，是基于提取试剂经济、环保、容易获得、试验方法便于推广使用的原则，并不说明这种方法是提取黄芩苷最高产出率的方法，因此按该试验方法测定穿梅三黄散中黄芩苷含量，也不表示是该兽药制剂中黄芩苷绝对含量。