黑老虎果实提取物对小鼠腹泻模型的干预作用

凌智辉，张天鹿，曾建国，唐 其，吴领席，陆 英，*

(1.湖南农业大学园艺学院，长沙 410128;2.国家中药材生产(湖南)技术中心，长沙 410128；3.湖南省通道县农业局，怀化 418000)

黑老虎(Kadsuracoccinea(Lem.) A. C. Smith)别名冷饭团、过山龙藤、血藤泡、布福娜等，是木兰科、南五味子属藤本类植物。黑老虎作为一种民间药物，药物部位主要为根、茎，味辛、微苦、性温，具有行气止痛、散淤通络的功效，主要用于治疗风湿痹痛、跌打损伤、胃病及妇科病等[1]。现代研究表明，黑老虎根茎中主要化学成分有木质素类和三萜类，还有单萜类、倍半萜类、甾体类等，其中木脂素类化合物主要为联苯环辛二烯型木脂素类，还有少量的芳基萘型和二苄基丁烷型木脂素类[2]，其他类型木脂素主要为芳基萘型木脂素 kadsuralignan C[3]、kadsuralignans H[4]和二苄基丁烷型木脂素 kadsuralignan G[5]；三萜类化合物有kadlongilactone型以及降三萜类等[6-7]；倍半萜有lospathulenol和naphthalene C等[8]。黑老虎中所得木脂素类化合物主要有抗肿瘤[9]、抗HIV[10]、保肝作用[11]、抗炎作用[12]；三萜类化合物具有抗肿瘤[13]、保肝作用[14]；其他类化合物还有抗氧化、调血脂、体外抑菌、杀虫、神经保护等作用[15]。

近年来，黑老虎果实作为一种特色水果在我国南方发展速度较快，种植面积快速增加，但黑老虎果实存在果皮厚，籽多，果肉量少的缺点，亟待深加工综合开发利用；笔者在黑老虎种植基地调研发现，当地老百姓有用黑老虎果皮治疗腹泻的案例，但未发现科学研究报导。腹泻是人畜共患的一种多种因素引起的肠道疾病，多采用抗生素进行治疗。近年来，由于抗生素类药物的大量使用，导致药物残留和环境污染等问题，具有抗腹泻作用的天然植物提取物替代抗生素成为人们研究的热点。采用细菌性腹泻小鼠和药物性腹泻小鼠模型对黑老虎果实提取物的主要成分及抗腹泻作用进行研究，为新药开发和畜禽养殖中疾病预防及治疗提供新的天然抗腹泻药物，也为黑老虎产业可持续发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性ICR小鼠210只，体重：18.0～22.0 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004，动物质量合格证号：1107272011000001，1107272011000003，1107272011000329，在湖南省药物安全评价研究中心屏障环境饲养，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2015-0016。

1.1.2 实验材料 黑老虎鲜果2019年11月采集于湖南省怀化市通道县黑老虎种植基地；大肠埃希氏菌Escherichia coli(ATCC25922)；羧甲基纤维素钠，批号：20170915，阿拉丁产品；蒸馏水。

1.2 仪器设备 ME2002E型电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 提取物制备 取黑老虎鲜果4000 g，用10倍40%乙醇在30 ℃超声提取三次，每次60 min,将提取液抽滤并合并，55 ℃减压回收乙醇，浓缩后冷冻干燥得黑老虎果实提取物。

1.3.2 提取物中主要成分含量检测 分别以五味子酯甲、齐墩果酸、芦丁为标准品，按文献[16-18]方法采用分光光度法测定黑老虎果实提取物中的木脂素类、三萜类、黄酮类化合物含量。

1.3.3 剂量设置 设置黑老虎果实提取物低、中、高剂量为50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。肠炎宁胶囊临床推荐用量6 g，根据人与动物体表面积换算动物等效剂量为6 g*0.0026/0.02 kg=0.78 g/kg。

1.3.4 黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响 ICR小鼠60只，雄性，体重18.0～22.0 g，按体重随机分为6组，每组小鼠10只，分别为：正常组、肠炎宁胶囊组、模型组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组。不同小组小鼠根据实验需求灌胃给予不同药物(表1)，连续给药7 d，给药体积为0.4 mL，每日给药1次，正常对照组和模型对照组小鼠每天给予同体积蒸馏水。除正常组其余小鼠于末次给药后30 min腹腔注射5×108CFU/mL的大肠埃希菌溶液，注射体积为0.4 mL。观察并记录各组小鼠注射大肠埃希菌后4 h内排便情况[19]，并计算小鼠腹泻率与腹泻指数。腹泻率=腹泻动物数/该组动物总数×100%；腹泻指数=稀便率×平均稀便级。稀便率为小鼠所排的稀便数与总便数之比。稀便级通过稀便滤纸的污染程度(直径大小)来进行分级，一共分为4级：小于1 cm为1级，1～1.9 cm为2级，2～3 cm为3级，大于3 cm为4级，不同级数表示每只动物稀便的程度的高低。平均稀便级=所有稀便级/稀便次数[20]。

表1 试验分组和剂量设计

1.3.5 黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响 ICR小鼠50只，雄性，体重：18.0～22.0 g，按体重随机分为5组，小鼠同1.4.3方法处理。除正常组其余小鼠于末次给药后30 min灌胃给予1 g/mL的番泻叶提取液，灌胃体积为0.4 mL，灌胃后将小鼠单个置于自制铁丝笼中，下方垫滤纸，滤纸间隔30 min更换1次，记录小鼠首次出现腹泻时间与6 h内稀便数量。

1.3.6 黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响ICR小鼠50只，雌雄各半，体重：18.0～22.0 g，按性别体重随机分为5组，分别为：正常组、肠炎宁胶囊组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组，每组10只，每天小鼠进行灌胃，灌胃药物剂量0.4 mL的相应药物，1次每日，连续7天进行给药，正常组小鼠灌胃0.4 mL蒸馏水，各组小鼠末次给药后30 min灌胃给予5%碳末，0.2 mL/只，30 min后处死小鼠，参照文献方法[21]，计算小肠碳末推进率。碳末推进率(%)=碳末在肠内推进距离/小肠全长×100%。

2 结果与分析

2.1 黑老虎主要化学成分定量检测 由图1可见，三个标准曲线R2>0.99，证明该方法线性范围良好，可用于含量测定。黑老虎果实提取物中木脂素、三萜和黄酮类化合物总量达到63%，其中木脂素类化合物含量最高。

图1 标准曲线图

表2 黑老虎果实提取物中主要化学成分含量

2.2 黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响 由表3可知，模型对照组相对于正常组，小鼠的腹泻潜伏时间明显减少(P<0.01)，小鼠腹泻指数明显增加(P<0.01)，表明造模成功。相对于模型组，肠炎宁组、黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠腹泻潜伏时间均有所延长，腹泻指数有所减少，其中黑老虎果实提取物低、高剂量组小鼠腹泻潜伏时间明显增加(P<0.05)，高剂量组腹泻指数明显减少(P<0.05)。黑老虎果实提取物低、中、高组小鼠腹泻率分别是：40%、40%、20%，相对于模型组都有所减少。黑老虎果实提取物高剂量组潜伏时间显大于肠炎宁组，腹泻指数显小于肠炎宁组，腹泻率低于肠炎宁组。

表3 黑老虎果实提取物对小鼠细菌性腹泻模型的影响(n=10)

2.3 黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响 如表4所示，相比于正常组，模型组小鼠腹泻潜伏时间明显减少(P<0.05)，稀便数量明显增加(P<0.01)。相对于模型组，肠炎宁胶囊组潜伏时间明显减少(P<0.05)，稀便数量有所减少，但不明显；黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠腹泻潜伏时间都没有明显改变，稀便数量都有明显减少(P<0.05)。相比于肠炎宁组，黑老虎果实提取物低、中、高剂量组潜伏时间都增加，稀便数量都有所减少；黑老虎低剂量组稀便颗数有显著差异。

表4 黑老虎果实提取物对番泻叶致小鼠腹泻模型的影响(n=10)

2.4 黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响 由表5可知，与正常组相比，黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠小肠碳末推进率无明显差异(P>0.05)，肠炎宁胶囊组小鼠小肠碳末推进率有所增加。与肠炎宁胶囊组相比，黑老虎果实提取物低、中、高剂量组小鼠小肠碳末推进率有所减少，但无显著差异。

表5 黑老虎果实提取物对小鼠小肠推进的影响(n=10)

3 讨论与结论

文献研究表明，具有抗腹泻的天然化学成分主要有鞣质类[23]、生物碱类[24-25]、三萜类、挥发油类[26]、黄酮类[27]、多酚类[27]、多糖及其他类化合物，主要从调节水和电解质平衡、抗炎、干预胃肠激素分泌、保护肠黏膜、促进肠道修复等方面作用；实验对黑老虎果实提取物中主要成分测定表明，提取物中含有较高的木脂素、三萜和黄酮类化合物，这三类成分均具有较好的抗炎作用。因此，可以推测，它们是黑老虎果实提取物具有抗腹泻作用的物质基础，且主要是通过抑制肠道炎症而产生抗腹泻作用，但具体作用机理还有待于进一步研究，具体化学组成也有待进一步分离与鉴定。

黑老虎果实提取物对细菌性致腹泻具有良好的抗腹泻作用，为新药开发和畜禽养殖中疾病预防及治疗提供了新的天然抗腹泻药物，也为黑老虎产业可持续发展奠定基础。