基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术分析经典名方芍药甘草汤的化学成分

续艳丽,李晨曦,杨飞霞,李晓春,武晓玉，3,4,夏鹏飞，3,4,赵磊，3,4

(1.甘肃中医药大学药学院,甘肃 兰州 730099;2.兰州市食品药品检验检测研究院,甘肃 兰州 730050;3.甘肃中医药大学甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室,甘肃 兰州 730000;4.甘肃省道地药材质量标准化技术研究与推广工程实验室,甘肃 兰州 730000)

芍药甘草汤又名“去杖汤”，是古代经典名方之一,源于医圣张仲景的《伤寒论》[1],组方精简,临床疗效确切,主治经筋挛急、脘腹疼痛等症。现代研究和临床实践也证实,芍药甘草汤具有显著的解痉、抗炎、镇痛、止咳、平喘等作用[2]。研究表明,芍药甘草汤中主要含有黄酮类、三萜皂苷类、单萜糖苷类、酚类等化合物[3]。但目前关于该方的研究主要集中在药效作用、临床应用及单味药材的化学成分方面,对其全面的化学成分解析尚未见报道。中药复方具有多成分、多靶点、多途径的作用特点,其复杂化学成分的分离与鉴定是阐明中药复方药效物质基础的前提。超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用(UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)技术[4],具有高分辨率、高扫描速率、精确的结构表征等优势,即使在没有对照品的情况下,也可以实现多种成分同时快速地鉴定和指认,已被广泛应用于中药单体及复方化学成分的快速筛查和定性分析。因此,在系统文献研究和数据库建立的基础上,本研究首次建立了UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法分析经典名方芍药甘草汤水煎液的复杂成分,根据精确相对分子质量、多级质谱碎片信息、对照品比对及文献报道,借助软件Mass Frontier 8.0预测裂解规律,共鉴定出129个化合物,主要包括黄酮类、萜类、酚类、香豆素类等,以期为探究该古代经典名方药效物质基础和作用机制奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

VanquishTMUHPLC超高效液相色谱系统，Q-ExactiveTM组合型四极杆OrbitrapTM质谱仪(Thermo Scientific公司)；MS205DU型十万分之一分析天平(Mettle Toledo公司)；Milli-Q®IQ7000超纯水系统(Merk公司)。

1.2 药物与试剂

白芍(产地：安徽，批号：201101)、炙甘草(产地：甘肃，批号：6221057)购自甘肃强生医药有限公司。异甘草素(批号:20112401)、光甘草定(批号:18083001)、甘草查尔酮A(批号:19102406)、甘草查尔酮B(批号:20121501)、芹糖甘草苷(批号:20111607)、甘草素(批号:17112302)、异甘草苷(批号:20042301)、氧化芍药苷(批号:19120604)、芍药内酯苷(批号:19122302)、没食子酰芍药苷(批号:171013)、芒柄花苷(批号:19071501)、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(批号:19010904)、苯甲酰芍药苷(批号:19103002)由成都格利普生物科技有限公司提供。槲皮素(批号:100081-201610)、甘草酸铵(批号:110731-202021)、甘草次酸(批号:110723-201715)、齐墩果酸(批号:110709-201808)、儿茶素(批号:110877-202005)、芍药苷(批号:110736-202044)、没食子酸(批号:110831-201906)、苯甲酸(批号:100419-201703)、水杨酸(批号:100106-202106)、丹皮酚(批号:110708-201908)、甘草苷(批号:111610-201908)、山柰酚(批号:111610-201908)、异鼠李素(批号:110860-202012)由中国食品药品检定研究院提供。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯,水为Milli-Q超纯水,其他化学试剂为分析纯。

2 方法

2.1 芍药甘草汤标准煎液制备

《伤寒论》中记载芍药甘草汤的煎煮方法“白芍、甘草(炙)各四两,以上二味,以水三升,煮取一升五合。”[1]根据汉代度量衡与经方换算,确定芍药甘草汤标准煎液的制备工艺[5]：称取白芍55.2 g,炙甘草55.2 g,加水600 mL,煎煮至约300 mL,得芍药甘草汤煎液。用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.2 对照品溶液制备

分别精密称取异甘草素、光甘草定、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、芹糖甘草苷、甘草素、异甘草苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、没食子酰芍药苷、芒柄花苷、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷、槲皮素、甘草酸铵、甘草次酸、齐墩果酸、儿茶素、芍药苷、没食子酸、苯甲酸、水杨酸、丹皮酚、甘草苷、山柰酚、异鼠李素加甲醇制成适宜质量浓度的对照品溶液,经0.22 μm微孔滤膜滤过,即得。

2.3 色谱条件

Thermo Scientific Hypersil GOLD C18色谱柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水溶液(B),梯度洗脱(0～2 min,5%A;2～42 min,5%～95%A;42～47 min,95%A;47～47.1 min,95%～5%A;47.1～50 min,5%A;流速0.3 mL·min-1,柱温30 ℃;进样量4 μL。

2.4 质谱条件

正离子模式检测条件:离子源HESI-Ⅱ;毛细管电压3.5 kV;源内温度350 ℃;毛细管温度320 ℃;扫描范围m/z100～1 500;S-lens为60;鞘气流速35 arb;辅助气流速10 arb;扫描模式Full MS/dd-MS2;分辨率Full MS模式70 000;分辨率dd-MS2模式17 500。

负离子模式检测条件:离子源HESI-Ⅱ;毛细管电压3.2 kV;源内温度350 ℃;毛细管温度320 ℃;扫描范围m/z100～1 500;S-lens为60;鞘气流速35 arb;辅助气流速10 arb;扫描模式Full MS/dd-MS2;分辨率Full MS模式70 000;分辨率dd-MS2模式17 500。

2.5 芍药甘草汤数据库的建立

通过检索TCMSP、TCMID、ChemSpider(http://www.chemspider.com/)等数据库,结合国内外文献报道,构建芍药甘草汤化学结构数据库。

2.6 数据处理

首先,根据建立的芍药甘草汤内部数据库筛选出分子式匹配、精确相对分子质量误差在5×10-6内的化合物为潜在的候选化合物。其次,对有标准品的化合物,直接通过比对出峰时间、准分子离子峰、二级碎片离子信息来鉴定确认。其他化合物根据出峰时间、准分子离子峰及二级碎片离子信息与中药成分高分辨质谱数据库(OTCML)进行比对指认;OTCML中查找不到的候选化合物,通过Mass Frontier 8.0软件,将化合物mol结构导入软件中进行裂解规律预测,对比二级碎片信息结合相关文献进行指认。

3 结果

3.1 色谱峰鉴定

采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS在“2.3”色谱和“2.4”质谱条件下对芍药甘草汤供试品溶液、对照品溶液分别进样分析。得正、负离子模式下的总离子流图,如图1所示。按照“2.6”数据处理方法,最终在芍药甘草汤中鉴定出129个化合物,其中黄酮类化合物82个、萜类化合物20个、酚类化合物10个,香豆素类化合物7个,其他类化合物10个。各化学成分的保留时间(tR)、准分子离子峰质荷比的理论值和测量值、碎片离子等数据,如表1所示。

图1 芍药甘草汤UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS总离子流图

表1 正、负离子模式下的芍药甘草汤中主要化合物的质谱信息

(续表一)

(续表二)

(续表三)

(续表四)

注:*为与对照品比对的化合物。

3.2 各类化合物的分析鉴定

3.2.1 黄酮类化合物的分析鉴定 黄酮类是芍药甘草汤中主要的化学成分,本研究基于UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术鉴定的黄酮类化合物主要包括甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素、芹糖甘草苷、芹菜素、儿茶素等。黄酮苷类化合物裂解一般为糖苷键裂解,其黄酮苷元的裂解主要为C环发生RDA裂解或者丢失H2O,CO,CO2等中性小分子。

化合物58和59的保留时间分别为9.69 min和12.51 min,具有相同的分子离子峰,且裂解规律相同,应为同分异构体。在负离子模式下化合物58的准分子离子峰为m/z417.119 42[M-H]-,脱去1分子葡萄糖(Glu)产生m/z255.066 19碎片离子,苷元进一步发生RDA裂解产生m/z135.007 37和m/z119.048 77碎片离子。化合物65和66的保留时间为13.44 min和17.49 min,具有相同的分子离子峰，应为同分异构体,化合物65在负离子模式下的m/z为255.065 64[M-H]-,RDA裂解产生m/z119.048 58和m/z135.007 16的碎片离子。以上数据与甘草苷、异甘草苷、甘草素、异甘草素对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[15]一致,故推测化合物58、59、65、66分别为甘草苷、异甘草苷、甘草素和异甘草素。甘草苷的二级质谱及裂解过程见图2～3。

图2 负离子模式下甘草苷的二级质谱

图3 甘草苷的主要裂解过程

化合物13的保留时间为5.65 min,在负离子模式下准分子离子峰为m/z289.070 47[M-H]-,C环丢失1分子H2O生成m/z271.059 88碎片离子,A环丢失1分子CO2产生m/z245.081 42碎片离子,B环处断裂得到m/z179.039 03碎片离子。儿茶素的质谱裂解过程主要分别发生在A环、B环和C环。以上数据与儿茶素对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[35]一致,故推测化合物为儿茶素。

化合物77保留时间为15.63 min,在负离子模式下准分子离子峰为m/z269.045 41[M-H]-,并产生二级碎片离子m/z225.055 13,m/z151.002 49,m/z117.033 00。m/z225.055 13是丢失1分子CO2产生的碎片,m/z151.002 49和m/z117.033 00是黄酮化合物C环发生RDA裂解生成的特征碎片离子。与芹菜素对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[26]一致,故推测化合物77为芹菜素。

化合物57保留时间为12.14 min,在负离子模式下的准分子离子峰为m/z549.160 64[M-H]-,产生二级碎片离子m/z417.118 35,m/z255.065 87和m/z135.007 46。m/z417.118 35是丢失1分子芹糖得到的碎片,再丢失1分子Glu得到m/z255.065 87碎片离子,继续失去1分子C8H8O得到m/z135.007 46碎片离子。与芹糖甘草苷对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[36]一致,故推测化合物57为芹糖甘草苷。

化合物111的保留时间为24.16 min,在负离子模式下的准分子离子峰为m/z323.128 33[M-H]-,丢失1分子C6H6O2得到m/z213.091 11碎片离子,再丢失1分子C和C5H6得到m/z201.091 13和m/z135.043 61碎片离子。与光甘草定对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[36]一致,故推测化合物111为光甘草定。

3.2.2 单萜及其皂苷类化合物结构鉴定 芍药苷及其衍生物的质谱裂解规律具有一定的相似性，m/z165的蒎烷基本骨架碎片离子为芍药苷衍生物的特征碎片离子,同时也会生成Glu、苯甲酸等不同基团的碎片离子。

化合物21，保留时间为8.36 min,在负离子模式下的准分子离子峰为m/z479.153 75[M-H]-,失去1分子甲醛得到m/z449.145 42碎片离子,再失去1分子苯甲酸形成m/z327.108 70碎片离子,m/z165.054 82为蒎烷基本骨架结构的碎片离子,m/z121.027 95是蒎烷基本骨架与苯甲酰取代基相连处断裂所得的碎片离子。化合物19保留时间为7.91 min,在负离子模式下的准分子离子峰为m/z479.153 75[M-H]-,产生与芍药苷基本相同的碎片离子。以上数据与芍药苷、芍药内酯苷对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[27]一致,故推测化合物21和19为芍药苷和芍药内酯苷。芍药苷的二级质谱图及主要裂解规律见图4～5。

图4 负离子模式下芍药苷的二级质谱图

图5 芍药苷的主要裂解过程

化合物75保留时间为15.51 min,负离子模式下的准分子离子峰为m/z583.181 03[M-H]-,其二级质谱中产生碎片离子m/z121.027 94,m/z165.043 62。m/z165.043 62是蒎烷骨架结构,也是芍药苷衍生物的特征碎片离子。m/z121.027 94为苯甲酰基碎片离子。以上数据与苯甲酰芍药苷对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[27]一致,故推测化合物75为苯甲酰芍药苷。

化合物12保留时间为5.65 min,负离子模式下的准分子离子峰为m/z495.150 36[M-H]-,氧化芍药苷与芍药苷结构十分相近,质谱裂解规律与芍药苷相似,m/z465.138 92为丢甲醛峰,m/z165.054 79是其蒎烷基本骨架结构的碎片离子,m/z137.022 92为对羟基苯甲酸碎片离子。以上数据与氧化芍药苷对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[27]一致,故推测化合物12为氧化芍药苷。

化合物34保留时间为10.26 min,负离子模式下的准分子离子峰为m/z631.166 32[M-H]-,同时其二级质谱中产生碎片离子m/z613.156 74,m/z491.130 36,m/z313.055 94。m/z613.156 74是脱去1分子H2O产生的二级碎片离子,再失去1分子苯甲酸产生m/z491.130 36碎片离子,继续失去1分子C10H9O3生成m/z313.055 94二级碎片离子。与没食子酰芍药苷对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[27]一致,故推测化合物34为没食子酰芍药苷。

3.2.3 三萜及其皂苷类化合物结构鉴定 化合物84保留时间为18.73 min,在负离子模式下的准分子离子峰为m/z821.397 83[M-H]-,并产生二级碎片离子m/z803.390 08,m/z759.396 48,m/z469.331 60,m/z351.056 24。m/z803.390 08为准分子离子峰失去1分子H2O得到的碎片离子,继续失去1分子CO2则得到m/z759.396 48碎片离子。准分子离子峰失去2分子葡萄糖醛酸(GlcA)产生m/z469.331 60碎片离子。化合物125保留时间为29.59 min,正离子模式下的准分子离子峰为m/z471.346 77[M+H]+,并产生二级碎片离子m/z407.328 74,m/z235.168 52,m/z189.163 67。m/z407.328 74为失去1分子HCOOH和1分子H2O得到的碎片。m/z235.168 52为分子离子峰失去1分子C15H24O2产生的碎片,继续失去1分子HCOOH得到m/z189.163 67的碎片。以上数据与甘草酸、甘草次酸对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[19]一致,故推测化合物84、125为甘草酸和甘草次酸。甘草酸的二级质谱图及主要裂解过程见图6～7。

图6 负离子模式下甘草酸的二级质谱图

图7 甘草酸的主要裂解过程

3.2.4 酚类化合物结构解析 芍药甘草汤中的酚类成分主要包括没食子酸、丹皮酚、邻苯三酚、没食子酸甲酯、水杨酸、原儿茶酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖等,质谱裂解规律较为简单,主要为各种取代基的丢失,一般在负离子模式下能得到较好的响应。

化合物3保留时间为1.32 min,一级质谱在负离子模式下的准分子离子峰为m/z169.013 06[M-H]-,二级质谱中产生的碎片离子m/z125.022 70是丢失羧基形成的碎片离子。以上数据与没食子酸对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[37]一致,故推测化合物3为没食子酸。

没食子酰葡萄糖类化合物的裂解方式主要为失去没食子酰基和没食子酸碎片形成,m/z169没食子酰基碎片离子是该类化合物的特征碎片离子。化合物38保留时间为10.49 min,负离子模式下的准分子离子峰为m/z939.111 45[M-H]-,失去1分子C7H5O4得到的m/z787.101 38碎片,再失去1分子C7H6O5得到m/z617.079 16,m/z465.067 41为m/z617.079 16继续失去1分子C7H5O4得到的碎片离子,m/z447.056 30为m/z617.079 16继续失去1分子C7H6O5得到的碎片离子。以上数据与1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对照品的保留时间和裂解规律相同,也与文献报道[37]一致,故推测化合物38为1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖。二级质谱图及裂解规律见图8～9。

图8 负离子模式下1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的二级质谱图

图9 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖的主要裂解过程

4 讨论

古代经典名方是指疗效确切，应用广泛并具有明显特色与优势的古代中医典籍所记载的方剂[38],芍药甘草汤源于医圣张仲景的《伤寒论》,临床疗效确切,由白芍、炙甘草两味药组成。现有研究表明其单味药材甘草的化学成分近300种,白芍与甘草配伍后化学成分更为复杂,也可能产生新的化学物质。因此,借助现代分析技术来探索芍药甘草汤的化学基础和有效成分,对其整体进行系统鉴定,是芍药甘草汤药效物质基础、作用机制、质量控制及新药二次开发与应用的基础。本研究首次建立了UHPLC-Q-Exactive Orbitrap MS方法分析经典名方芍药甘草汤水煎液的复杂成分,根据精确相对分子质量、多级质谱碎片信息、对照品比对及文献报道,借助软件Mass Frontier 8.0预测裂解规律,共鉴定出129个化合物,主要包括黄酮类、萜类、酚类、香豆素类等,与相关文献报道一致[2]。同时结合对照品确认26个化合物,主要包括异甘草素、甘草素、异甘草苷、甘草苷、光甘草定、甘草查尔酮A、甘草查尔酮B、芹糖甘草苷、芒柄花苷、槲皮素、儿茶素、山柰酚、异鼠李素等13个黄酮类化合物，芍药苷、氧化芍药苷、芍药内酯苷、苯甲酰芍药苷、没食子酰芍药苷等5个单萜及皂苷化合物，甘草酸、甘草次酸等2个三萜皂苷类化合物，没食子酸、齐墩果酸、丹皮酚、水杨酸、1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖等5个酚类化合物和苯甲酸。现有研究表明,芍药甘草汤中甘草酸铵、芍药苷、苯甲酰芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷、甘草酸、甘草苷、异甘草素、异甘草苷等化合物可协同作用于中枢或外周神经,通过抑制致痛物质氧自由基(OFR)产生而发挥解痉镇痛作用[39-40]。芍药苷可通过肠道细菌代谢转化为芍药苷代谢素Ⅰ(PM-Ⅰ)发挥解痉作用[41],甘草酸可通过降低HIF-1α表达来抑制TNF-α和IL-6的释放,从而起到保护急性肺损伤的作用[42-43]。甘草查尔酮A也具有明显的抗炎活性,可通过调控MAPK信号通路抑制类风湿关节炎滑膜成纤维细胞(MH7A)增殖、诱导细胞凋亡和抑制炎症因子的表达而发挥抗关节炎作用[44]。芍药苷、芍药内酯苷等三萜皂苷化合物是芍药甘草汤保肝的主要药效物质[2]。芍药甘草汤作为古代经典名方目录之一,临床疗效确切,本研究结果可为后期进一步研究芍药甘草汤的药效物质基础及作用机制提供参考。