花冠闭合现象对高山植物喉毛花繁殖适合度的影响

安宇梦，李先婷，王培正， 张婵

(河南师范大学生命科学学院，河南 新乡 453007)

植物的生长发育过程受到多种环境因素的影响，植物的繁殖阶段对外界环境变化尤为敏感[1].低温胁迫、暴雨频发是青藏高原及周边高山地区的典型气候特征[2]，恶劣的生境条件对植物的繁殖过程产生极大影响.低温不仅限制高山生态系统中传粉昆虫的活动能力，还影响受精后植物的胚胎发育过程，并最终影响果实和种子的发育和成熟[3]；雨水则直接冲刷花粉并降低花粉萌发率[4].因此，在青藏高原极端恶劣的生境条件下，高山植物进化出一系列适应性策略以保障繁殖成功，表现出对环境高度特化的响应[2].菊科的水母雪兔子(Saussureamedusa)和绵头雪兔子(Saussurealaniceps)等棉毛植物的苞片上密布毛状体，浓密绒毛具有吸热和保温作用的同时也可以防止雨水对繁殖器官造成伤害[4-5].蓼科的塔黄(Rheumnobile)和菊科的毡毛雪莲(Saussureavelutina)等温室植物花序外围半透明的苞片可以起到保温作用，有助于植物胚胎的早期发育，提高种子的产量[6-7].另外，一些植物在不同生活史阶段采取相应的进化策略来适应外部环境变化，例如茄科植物赛莨菪(Anisodusluridus)在花期时花梗向下弯曲，有效防止了雨水对花粉的冲刷；在果期时花梗直立，则可以使宿存花萼贮水；由于水具有维持温度稳定的作用，花萼贮水能够有效促进果实发育，提高种子数量和萌发率[8].

花冠闭合现象是高山植物应对低温多雨环境的又一独特适应机制[9].花冠闭合现象分为暂时性花冠闭合和永久性花冠闭合两类.暂时性花冠闭合现象是指在夜晚或暴风雨来临前或者周围环境温度骤降时，植物花冠迅速闭合，当天气好转或温度回升后再重新开放的现象，具有可逆性；而永久性花冠闭合现象是指植物花冠在完成授粉后永久闭合不再开放的现象[5，10].两种花冠闭合现象在龙胆科植物中均较为常见[11]，是龙胆科植物对低温多雨高山环境的一种适应性策略，但花冠闭合现象对植物雌雄繁殖适合度的影响及其适应性意义的相关研究却少有报道.本文以龙胆科一年生草本植物喉毛花(Comastomapulmonarium)为研究对象，测量花冠开放和闭合过程中的环境温度变化，观测人工授粉对花冠开合状态的影响，并比较人为制止两种花冠闭合现象后其雌雄繁殖适合度的变化情况，旨在探讨喉毛花两种花冠闭合现象的诱导机制，暂时性花冠闭合现象和永久性花冠闭合现象对喉毛花雌雄繁殖适合度的影响，以及喉毛花的花冠闭合现象对高山极端环境适应性的意义.

1 材料与方法

1.1 研究地点

本研究于2016年7～8月在中国科学院海北高寒草甸生态系统定位观测站(下文简称海北站)(N 37°29′～37°45′,E 101°12′～101°23′)开展.海北站地处青藏高原东隅，祁连山北支冷龙岭东段南麓的大通河河谷西段，海拔3 200～3 600 m.属于典型的高原大陆性气候，年平均气温-1.7 ℃，年极端最高气温27.6 ℃，极端最低气温-37.1 ℃，年内没有绝对无霜期.年平均降水量426～860 mm，且主要集中在5～9月.典型植被类型为以金露梅(Potentillafruticosa)为建群种的高寒灌丛草甸和以嵩草属(Kobresia)植物为建群种的高寒嵩草草甸[12].

1.2 研究材料

喉毛花，龙胆科喉毛花属一年生草本，分布在海拔3 000～4 800 m的高山地区，高5～30 cm.淡蓝色花单生茎顶或枝顶，主花轴通常产生数个侧枝.喉毛花的花冠呈管状，裂片基部有一圈白色毛状副冠.雄蕊5，着生于花冠筒上.果实为蒴果，种子小，微外露.海北站地区的喉毛花主要通过自交产生种子，并且存在严重的近交衰退现象[13].

1.3 研究方法

1.3.1 两种花冠闭合现象的诱导机制

1.3.1.1 暂时性花冠闭合现象 在清晨花冠开放和傍晚花冠闭合过程中，随机标记20朵喉毛花顶花，每5 min记录一次花冠直径并用手持式温湿度记录仪(OM-EL-USB-2-LCD,OMEGA,USA)测量花冠近旁气温，直至20朵顶花完全开放或完全闭合.

1.3.1.2 永久性花冠闭合现象 随机标记40个植株，平均分为2组，在花蕾期对顶花进行去雄，其中1组待柱头张开后人工授异花花粉，另外1组不授粉维持自然状态，分别记录两组植株顶花的单花寿命.

1.3.2 两种花冠闭合现象对喉毛花繁殖适合度的影响

1.3.2.1 发育胚珠数量、受精率 随机选取并标记60个植株的顶花花蕾，平均分为3组，一组待其顶花开放后，用透明胶布粘贴固定其花瓣使之无法正常闭合，该处理目的为制止暂时性和永久性花冠闭合现象(T1)；第二组待其顶花自然授粉完成且花冠永久闭合后，将花瓣拨开并用透明胶布固定以制止永久性花冠闭合现象(T2)；最后一组不作任何处理作为对照(CK).由于喉毛花的败育种子在果实成熟时会消失而难以统计结籽率，但是其未受精的胚珠和受精胚珠可以清晰区分，因此该研究采用受精率代替结籽率.待开花两周后，取上述3组喉毛花的顶花，用解剖刀剖开其子房，在体式显微镜下分别统计各子房内发育胚珠和未发育胚珠的数量，并计算受精率.

受精率=发育胚珠数/总胚珠数

1.3.2.2 种子数及百粒质量 重复1.3.2.1中的3组处理，待各株的顶花果实发育成熟后，采集分装在纸袋内带回实验室统计种子数量.将各组种子自然干燥一个月后，用万分之一电子天平分别称量其百粒质量，重复20次.

1.3.2.3 种子萌发率 将1.3.2.2中称量结束后的种子置于-20 ℃冰箱内进行一个月的春化处理，随后在24 ℃的培养箱内进行萌发.将3组种子分别放置于表面被湿润滤纸包裹、直径为6 cm的小培养皿上，每组重复3次.将每组的3个小培养皿放入直径为15 cm、装有少量蒸馏水的大培养皿中.每日两次统计每个小培养皿上萌发的种子数量(当胚根长度大于0.5 mm时即视为萌发)，注意将发霉种子移出培养皿并记录数量，同时适时补充蒸发掉的水分以保持滤纸湿润.记录持续进行到连续5 d没有新的种子萌发为止，最后计算每个小培养皿上的种子萌发率.

种子萌发率=萌发种子数量/总种子数量

1.3.2.4 剩余花粉数量 重复1.3.2.1中的3组处理.由于喉毛花的雄蕊先熟，单花花期为4～5 d，散粉期为2～3 d，在各植株顶花开始散粉后注意观察，若标记植株的顶花在其花期第2天18∶00前经历1 h以上的较强降雨(即花药经历了雨水冲刷)，则用镊子摘取全部5枚雄蕊，统计花粉数量以检验两种花冠闭合现象在削弱雨水对花粉冲刷过程中的作用.若标记植株未经历雨水冲刷，则重新标记新的顶花花蕾并重复1.3.2.1中的3组处理方法，直至所有用于统计剩余花粉数量的顶花在开始散粉后均已经历降雨过程.将各处理中所取的雄蕊分别置于1 mL FAA固定液(福尔马林∶乙酸∶95%乙醇体积比 5∶5∶90)中，依据Dafni[14]的方法，加入少量混合试剂(50%乙醇加入适量洗涤剂充分混匀)定容至2 mL，充分震荡摇匀，使剩余花粉粒均匀分散在溶液中，用微量移液器吸取5 μL置于载玻片上，在光学显微镜下统计每滴溶液中的花粉数量，重复计数10次，按比例计算每朵花的剩余花粉数量.

1.3.2.5 花粉萌发率 选取50个正在散粉的喉毛花顶花，每朵随机摘取1枚正在散粉的新鲜花药，平均分为两组，将其中一组25枚花药分别置于装有10%蔗糖溶液(常用于花粉体外萌发，接近于自然状态下的花粉萌发环境[15])的离心管中；另外一组25枚花药分别置于装有蒸馏水的离心管中.两组花粉各自萌发8 h后，在100倍光学显微镜下观察花粉萌发情况，以检测雨水浸泡对花粉萌发率的影响，当花粉管长度大于花粉直径即视为萌发，最后计算花粉萌发率.

花粉萌发率=萌发花粉数量/总花粉数量

1.4 统计分析

采用SPSS16.0 for Windows软件进行平均值和标准误的计算，用单因素方差分析(One-way ANOVA)和LSD Post-hoc比较制止暂时性花冠闭合、制止永久性花冠闭合以及对照3组数据之间的差异性；用独立样本t检验比较人工授粉与否对喉毛花单花寿命的影响，以及喉毛花在蔗糖溶液和蒸馏水中花粉萌发率之间的差异性.

2 结果与分析

2.1 两种花冠闭合现象的诱导机制

在花冠开放和花冠闭合过程中，喉毛花的花冠直径与近旁气温呈显著正相关关系(P<0.01,图1)，说明喉毛花暂时性花冠闭合现象受低温诱导.人工授粉处理组的单花寿命显著低于自然状态下的未授粉组(t=6.846,P<0.01,表1)，说明授粉因素诱导喉毛花发生永久性花冠闭合.

表1 授粉对单花寿命的影响

图1 花冠直径与近旁温度的回归关系

2.2 两种花冠闭合现象对繁殖适合度的影响

制止暂时性和永久性花冠闭合现象的T1处理组中受精率(P<0.01)、种子数量(P<0.01)、种子百粒质量(P<0.01)、种子萌发率(P<0.01)和剩余花粉数量(P<0.01)均较对照(CK)显著降低，而发育胚珠数在两组间无显著差异(P=0.221,表2).

制止永久性花冠闭合现象的T2处理组与对照(CK)相比，种子百粒质量(P<0.01)和种子萌发率(P<0.01)显著降低，而发育胚珠数(P=0.867)、受精率(P=0.581)、种子数量(P=0.492)和剩余花粉数量(P=0.446)与对照组均无显著差异(表2).另外，T1处理组中受精率(P<0.01)、种子数量(P<0.01)和剩余花粉数量(P<0.01)均显著低于T2处理组(表2).

表2 花冠闭合现象对繁殖适合度的影响

在蒸馏水中浸泡萌发8 h后的花粉萌发率显著低于在接近自然萌发环境的10%蔗糖溶液中浸泡萌发相同时间的花粉萌发率(t=30.67,P<0.01)(表 3).

表3 水浸泡对花粉萌发率的影响

3 讨论

喉毛花的暂时性花冠闭合现象除影响剩余花粉数量及其雄性繁殖适合度，同时也通过影响种子数量影响其雌性繁殖适合度.制止暂时性花冠闭合现象后，喉毛花的剩余花粉数量减少，受精率降低，并最终引起种子数量减少.首先，由于缺少闭合花冠的保护作用，雨水会冲刷掉花药和柱头上落下的花粉，造成花粉的损失[8].另外，雨水的长时间浸泡会使花粉粒吸水胀破失去活性，从而降低花粉质量[9，16-17].

本研究中喉毛花的花粉在蒸馏水中浸泡后，其萌发率显著低于浸泡在接近花粉萌发环境的10%的蔗糖溶液，这表明雨水浸泡影响花粉质量.雨水对花粉数量和质量的影响不仅会降低植物的雄性繁殖适合度，还会进一步造成胚珠受精率的降低以及种子数量的减少，从而影响雌性繁殖适合度[18].前人也有研究证实了暂时性花冠闭合现象对龙胆科高山龙胆(Gentianaalgida)和麻花艽(Gentianastraminea)雌雄繁殖适合度的影响[9，19].青藏高原地区降雨集中发生于7月和8月，而此时正值喉毛花的盛花期，暴雨来临前往往伴随着周围环境温度的骤降，因此，这种低温诱导的暂时性花冠闭合现象是喉毛花对该地区夏季频发暴雨的一种适应机制，能够有效保护雌雄配子免受雨水的损害，提高喉毛花的雌雄繁殖适合度.

授粉因素诱导喉毛花发生永久性花冠闭合，人工授粉后单花寿命显著缩短.以往的研究也表明，柱头接受花粉后，植物的花寿命会显著缩短[20-21].一种解释是授粉后花寿命缩短受花粉提供者主导，花粉到达柱头后就会排斥后来花粉，从而独占受精的机会，授粉后植物组织内产生乙烯，诱导花的萎蔫，缩短花寿命，从而在与其他花粉的父权竞争中取得优势[22-25]；另一种解释是授粉诱导的永久性花冠闭合降低了蒸腾作用引起的水分损失[26]以及花的呼吸作用[27]和花蜜生产[28]等资源消耗，这对于在高山极端生境下减少维持花冠开放的资源消耗具有重要意义.永久性花冠闭合现象对喉毛花的雌性繁殖适合度具有重要影响，制止永久性花冠闭合现象后，喉毛花的种子百粒质量和萌发率显著降低.首先，永久性花冠闭合保护子房避免植食者啃食[19]，更为重要的是，青藏高原地区昼夜气温波动较大且生长季短暂，花冠永久性闭合可以保护生殖器官免受低温伤害，使子房内部温度趋于稳定，促进花粉管的伸长，加速受精胚珠的生长，为种子在较短时间内发育成熟提供保障，这对于种群后期开放的花尤为重要[9-10，19，29].

在生长季昼夜温差波动大，夏季暴雨频发的高山地区，温度、降水等非生物因素在高山植物花部特征演化中发挥着重要作用[30].喉毛花的花冠闭合现象是应对高山地区恶劣生境和极端气候条件的一种适应性进化策略.喉毛花的两种花冠闭合现象在诱导机制以及对繁殖适合度的影响方面均存在差异，暂时性花冠闭合现象受低温诱导，而永久性花冠闭合现象受到授粉因素的影响；暂时性花冠闭合现象通过影响花粉数量和质量进而影响种子数量，而永久性花冠闭合现象通过影响授粉后胚胎发育过程影响种子质量，两种花冠闭合机制共同影响喉毛花的雌雄繁殖适合度.龙胆科植物中普遍存在的花冠闭合现象是自然界长期自然选择的结果，是龙胆科植物能够广布于高山地区，对严酷的高山环境具有极强适应能力的原因之一.