猪miR-96-5p组织表达谱及其关键靶基因分析

杨敏，滚双宝,2，闫尊强，王鹏飞，杨巧丽，黄晓宇，唐于然，石海霞，马艳萍，赵进

(1.甘肃农业大学动物科学技术学院，甘肃 兰州 730070；2.甘肃省现代养猪技术工程研究中心，甘肃 兰州 730070；3.甘肃农业大学图书馆，甘肃 兰州 730070；4.甘肃省灵台县什字镇畜牧开发服务站，甘肃 平凉 744404)

microRNA(miRNA)是一类长约22个核苷酸的内源性非编码的单链RNA分子，主要通过与靶mRNA的3′UTR区特异性结合降解靶基因mRNA或抑制其正常翻译，在转录后水平以序列特异性的方式调控靶基因的表达[1]，能够在众多生理、病理过程中发挥重要功能[2].

诸多学者对miRNA在猪病毒性、细菌性肠道疾病发生、发展过程中的作用开展了大量研究.吴俊静等[3]研究报道，miR-27b-3p能显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV)在宿主细胞中的增殖；Yao等[4]研究发现，miR-143和miR-26在沙门氏菌感染猪的发生发展中起着重要的调控作用；訾臣[5]研究发现，miR-192和miR-7136-5p能通过调控其相应的靶基因在断奶仔猪对大肠杆菌侵袭、维持肠道稳定、免疫调控等方面发挥重要的调控作用.以上研究表明，miRNA在猪病毒性和细菌性肠疾病发生的过程中发挥着重要的作用.产气荚膜梭菌，又称魏氏杆菌，能够引起动物腹泻、肠毒血症等肠道疾病[6-7].Dinh等[8]和Hong等[9]研究证明，肉仔鸡在感染产气荚膜梭菌后，其小肠中miRNA表达发生了明显变化.Hong等[10]研究报道，被灌服产气荚膜梭菌后的罗斯鸡出现腹泻现象；郭宇[11]和王玉建等[12]研究发现，羔羊在感染产气荚膜梭菌后出现腹泻并呈现出典型的小肠溃疡现象.这些研究表明，miRNA在鸡、羊等动物感染产气荚膜梭菌引起的腹泻等疾病中起着重要作用.根据产气荚膜梭菌产生致病性毒素的不同，将其分为A、B、C、D和E 5种类型[13]，其中，C型产气荚膜梭菌是引起仔猪腹泻的重要病原菌之一[14].Petit等[15]研究发现，C型产气荚膜梭菌侵入机体后，粘附到小肠上皮细胞的绒毛顶端，并能够在绒毛基底膜处大量繁殖，其产生的毒素直接或间接作用于肠绒毛和内皮细胞，导致上皮细胞损伤和坏死，引起绒毛粘膜或组织出血、坏死，进而导致仔猪腹泻.

目前，有关miR-96-5p的研究多集中在癌症和肿瘤方面，已有研究表明，miR-96-5p可以通过靶向作用于转移抑制蛋白1(metastasis suppressor 1，MTSS1)、窝蛋白-l(caveolae-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteinyl aspartate-specific protease-9，caspase-9)等基因参与结肠癌、卵巢癌、肝癌、甲状腺癌、膀胱癌、肾上腺皮质和肾上腺髓质肿瘤等多种疾病的发生发展过程[16-20].本课题组前期对感染C型产气荚膜梭菌仔猪的回肠组织进行了Illumina Solexa高通量测序，发现差异表达miRNA共有53个，对测序数据进行深入分析，发现差异表达的miR-96-5p很可能在仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中起重要调控作用[21]，但是miR-96-5p在仔猪各组织中的表达情况以及其通过哪些靶基因及通路发挥功能尚不清楚，还有待开展相关研究.本研究拟采用RT-qPCR检测miR-96-5p在仔猪不同组织中的表达量，从而构建组织表达谱，利用生物信息学方法预测其靶基因并进行GO功能和KEGG通路富集分析，筛选和鉴定miR-96-5p靶向调控C型产气荚膜梭菌感染的关键靶基因，以期进一步加深miR-96-5p在调控仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染过程中的具体分子机制研究，为培育抵抗C型产气荚膜梭菌性腹泻猪品系提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验动物选用体质量和初生重基本相同且大肠杆菌、沙门氏菌和产气荚膜梭菌抗体均为阴性的健康仔猪30头，从中随机挑选5头作对照组(IC)，其余25头攻毒，攻毒组仔猪每头每天灌服C型产气荚膜梭菌C59-2标准菌株培养液1 mL，而对照组仔猪则灌服等量不含菌液的培养液，试验期5 d[22].参考腹泻评分标准对各仔猪腹泻进行评分[23]，根据腹泻总评分将攻毒组仔猪由高到低进行排序，前五名及后五名分别分为易感组(IS)和耐受组(IR).试验期满后屠宰仔猪，采集心、肝、脾、肺、肾、十二指肠、空肠、回肠等组织，液氮速冻保存，带回实验室后-80 ℃超低温冰箱保存.

1.2 试验试剂

Trizol试剂购自北京全式金生物技术有限公司(北京，中国)；mRNA反转录试剂盒Prime SeriptTMreagent Kit with gDNA Eraser、miRNA反转录试剂盒miRNA First Strand Synthesis Kit试剂盒、荧光定量试剂盒TB Greenser with gDNTaqTMaqGr(Tli RNaseH Plus)均购自宝生物工程有限公司(大连，中国).

1.3 总RNA提取及cDNA合成

参照Trizol使用说明书，用Trizol法提取仔猪各组织总RNA，使用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，再用凝胶电泳检测其完整性，合格后的总RNA于-80 ℃冰箱保存备用.

1.4 引物的设计与合成

从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中选取试验验证所需的基因及内参基因GAPDH的mRNA序列，采用Primer Premier 5.0和Primer-BLAST软件设计引物.在miRBase数据库上查找猪miR-96-5p的成熟体序列(UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU)，设计上游引物(GGCACTAGCACATTTTTGCT)，下游使用试剂盒自带通用引物，以U6为内参.引物由金唯智生物科技有限公司(苏州)合成，引物详细信息见表1.

表1 引物信息

1.5 miR-96-5p在不同物种中的保守性分析

在miRBase数据库(http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/)中下载人(Homosapiens)、大鼠(Rattusnorvegicus)、小鼠(Musmusculus)、猪(Susscrofa)、大西洋鳕(Gadusmorhua)、鸭嘴兽(Ornithorhynchusanatinus)、安大略鲑(Salmosalar)、锦龟(Chrysemyspicta)、家兔(Oryctolaguscuniculus)、斑马鱼(Daniorerio)、九带犰狳(Dasypusnovemcinctus)、原鸽(Columbalivia)、中央狐蝠(Pteropusalecto)、豚鼠(Caviaporcellus)等14个物种miR-96-5p的成熟序列，采用MEGA 5.0软件分析其保守性.

1.6 miR-96-5p靶基因预测及功能分析

由于目前关于miRNA靶基因预测数据库中尚无猪这一种属，因此将miR-96-5p按照序列比对至人的miRNA，再通过TargetScan(http://www.targetscan.org/)、miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)、miRDB(http://www.mirdb.org/)3种数据库预测miR-96-5p靶基因，利用Venny在线软件(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)取3种数据库的交集；然后结合miRTarBase(http://miRtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/browse.php)数据库中已验证的miR-96-5p靶基因，共同组成miR-96-5p的靶基因集合.利用DAVID Bioinformatics Resources 6.7中的Functional Annotation Tool对miR-96-5p的预测靶基因进行Gene Ontology(GO)和KEGG-Pathway通路富集分析.

1.7 RT-qPCR检测

2 结果与分析

2.1 miR-96-5p的保守性分析

在miRBase数据库中检索出人、大鼠、小鼠、猪、大西洋鳕、鸭嘴兽、安大略鲑、锦龟、家兔、斑马鱼、九带犰狳、原鸽、中央狐蝠、豚鼠14个物种miR-96-5p的成熟序列，进行对比分析(表2)，结果发现miR-96-5p的成熟体序列为：UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，在各个物种(如人、大鼠、家兔)之间具有高度的保守性.

表2 多个物种(miR-96-5p)成熟体序列

2.2 miR-96-5p的组织表达谱构建

本研究对对照组仔猪各组织中的miR-96-5p进行了定量分析，结果发现，miR-96-5p在空肠中的表达量最高，其次为肺、回肠组织，在肝、肾、十二指肠和胃中度表达，心脏和脾脏中表达量较低(图1).

不同大写字母表示差异极显著(P<0.01).

2.3 miR-96-5p靶基因预测

选择TargetScan、miRWalk和miRDB 3款生物信息学软件预测miR-96-5p的靶基因，分别得到418、1 101和10 189个靶基因，3款软件交集的共有179个基因(图2)，合并miRTarBase数据库中已知的21个靶基因，去掉7个重复，将最终获得的193个靶基因作为后续GO功能和KEGG通路富集分析的靶基因集合.

图2 miR-96-5p靶基因交集预测

2.4 miR-96-5p靶基因GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1 miR-96-5p靶基因GO功能分析 对获得的193个靶基因集合进行GO功能条目注释分类和富集分析，结果发现(表2)，在生物学过程(biological process，BP)层面，miR-96-5p靶基因主要显著富集在肌动蛋白细胞骨架组织、大脑皮层发育、经典Wnt信号通路的负调控、平滑肌组织发育、通路受限的SMAD蛋白磷酸化的负调控、神经元干细胞群维持、蛋白酶体泛素依赖蛋白分解代谢过程的正调控、神经元凋亡过程的正调控GO功能条目中(P<0.01)；在细胞组分(cellular component，CC)层面，靶基因显著富集于树突、神经元胞体GO条目中(P<0.01)；在分子功能(molecular function，MF)层面，靶基因显著富集于金属离子结合、序列特异性DNA结合GO条目中(P<0.01).

2.4.2 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析 对预测所得靶基因集合中的193个基因进行信号通路富集分析，结果发现(图3)，在KEGG数据库中，miR-96-5p预测的靶基因集合显著富于ErbB、MAPK、FoxO、PI3K-Akt、癌症中的通路等12个信号通路和前列腺癌、胶质瘤、癌症中的转录失调、子宫内膜癌等8个与疾病相关的通路.其中与免疫炎症反应和感染性疾病相关的ErbB、MAPK信号通路也发生了显著富集(P<0.05).

图3 miR-96-5p靶基因KEGG通路富集分析

表3 miR-96-5p的靶基因统计

表4 miR-96-5p靶基因GO富集分析

2.5 RT-qPCR分析结果

miR-96-5p的RT-qPCR结果与高通量测序结果基本一致(图4-A～B).对miR-96-5p的2个关键的靶基因(FOXO1、MAP2K1)的表达量进行了RT-qPCR检测，发现靶基因FOXO1和MAP2K1的表达量与miR-96-5p成相反趋势，并且两个靶基因的表达趋势均表现为，IR和IS组极显著低于IC组(P<0.01)，IS组极显著低于IR组(P<0.01，图4-C～D).

IC：对照组；IR：耐受组；IS：易感组；**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05).

3 讨论

miRNA在生物体内具有重要的调控功能，涉及到生物体生命活动的各个方面，包括生长发育、器官形成、细胞分化及凋亡和多种疾病(如腹泻)的发生发展[24].Zheng等[25]研究发现，miR-221-5p在预防和治疗猪流行性腹泻病毒的感染的过程中起重要作用.Yao等[26]研究发现，miR-221、miR-125b和miR-27b在猪抵抗沙门氏菌感染导致腹泻过程中起重要作用.孙倩[27]研究发现，miRNAs可以起刺激MAPK和PIK3-Akt等信号通路的作用，进而影响肠道免疫因子，影响仔猪肠道的健康.腹泻在养猪生产中普遍存在，是导致仔猪死亡的主要原因[28]，严重影响了养猪业的经济效益.仔猪腹泻与饲养管理、病原菌感染、遗传等因素密切相关[29]，病原菌感染引起仔猪腹泻在生产中常见，其中C型产气荚膜梭菌是引起仔猪腹泻的病原菌之一[14,30]，其主要寄生并侵袭仔猪肠道，从而引起腹泻[31].本课题组前期对感染C型产气荚膜梭菌仔猪回肠组织进行了高通量测序，筛选出差异表达miR-96-5p，推测其可能在仔猪感染C型产气荚膜梭菌性腹泻的过程中发挥着重要的作用[21].

诸多研究表明，miRNA的表达具有组织特异性[27]，这种特异性表达与其发挥的特异性功能密切相关[31]，Liang等[33]和Chan等[34]研究发现，miR-183、miR-135和miR-150等能够在猪脂肪组织中特异性表达，具有促进脂肪沉积的作用；吴正常等[35]研究发现，miR-215和miR-192可以在猪肠道部分特异性表达，能够参与维持断奶仔猪肠道正常功能，并在心、肝、脾、肺、肾、胃、肌肉、胸腺和淋巴等组织器官中呈中低表达.王伟等[31]研究发现，miR-204在猪与免疫炎症相关的组织器官中特异性表达，发挥着与免疫相关的作用，miR-204还在肾脏组织及小肠各段组织中呈中高度表达.本研究通过构建miR-96-5p的组织表达谱，发现miR-96-5p在猪空肠、回肠等肠道组织高表达，十二指肠部分中度表达(图1)，这说明miR-96-5p在肠道部分具有组织表达特异性，推测其在维持仔猪肠道正常功能方面具有重要作用.

本课题组前期对感染C型产气荚膜梭菌仔猪回肠组织进行了高通量测序，筛选出了差异表达miR-96-5p[21]，推测其可能是仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌感染的重要miRNA分子.本研究预测了miR-96-5p的靶基因集合并对其进行了KEGG富集分析，结果发现miR-96-5p的靶基因显著富集于一些与腹泻、肠道炎症等疾病相关的信号通路，如ErbB信号通路和MAPK信号通路.Yan等[36]和Yang等[37]的研究也发现，MAPK通路在小鼠肠道炎症的治疗、改善肠道疾病以及维护肠粘膜屏障的完整性方面起着重要的作用；Zhang等[38]研究发现，镰刀菌源真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌醇通过激活MAPK信号通路诱导猪小肠上皮细胞产生炎症因子；Duan等[39]研究发现，通过肠上皮中的钾通道和氯通道激活ErbB通路可抑制腹泻.由此我们推测，显著富集的ErbB和MAPK信号通路上的基因在仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻中有重要调控作用.经初步筛选，得到2个显著富集的ErbB和MAPK信号通路上miR-96-5p的靶基因FOXO1和MAP2K1，已有报道指出FOXO1基因是一种著名的肿瘤抑制基因，可以调控DNA的修复和细胞周期的转变[40]，马莉莉[41]在研究牛病毒性腹泻病毒过程中，将牛病毒性腹泻病毒感染的胎牛肾细胞，经测序发现FOXO1基因差异表达，说明FOXO1在病毒性腹泻病毒感染的疾病中起作用；Yang等[42]在炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的研究中发现，高表达的miR-425靶向调控FOXO1促进淋巴细胞生成大量的炎性因子Th17，说明FOXO1的下调表达会促进炎性因子的生成，这与本试验中仔猪在感染C型产气荚膜梭菌后，相比较于IC组仔猪，IR组与IS组仔猪回肠的表达量明显下调结果一致.MAP2K1基因，又称Mek1，是蛋白激酶家族的成员之一[43].曹燕飞[44]研究发现，通过上调实验大鼠结肠粘膜组织MAP2K1基因的表达，发现对溃疡性结肠炎起到了治疗作用，说明MAP2K1基因起到了抑制炎症作用；宋金杨[45]在研究中发现，MAP2K1是miR-181a的靶基因，miR-181靶向调控MAP2K1的表达进而调节下游NLRP3炎症通路激活，说明MAP2K1基因下调表达可起到促进炎症作用，而上调表达时则会抑制炎症，这与本试验中仔猪在感染C型产气荚膜梭菌后，MAP2K1基因在IC组、IR组和IS组表达量依次降低的结果相符合.因此，推测这些关键靶基因(FOXO1和MAP2K1)可能在仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻的过程中起着重要的作用.

4 结论

仔猪回肠组织中高表达的miR-96-5p可能通过调控ErbB、MAPK信号通路中的关键靶基因MAP2K1和FOXO1来参与仔猪抵抗C型产气荚膜梭菌引起的腹泻过程，起抑制仔猪肠道组织中的炎症反应的作用，该研究结果可为深入研究C型产气荚膜梭菌感染导致仔猪腹泻的分子机理提供参考.