地黄中益母草苷对食管癌细胞增殖抑制作用的研究

田平平，潘 颖，施 维，刘 佳，于春雷*

（1.安徽医学高等专科学校，安徽合肥 230601；2.川北医学院，四川南充 637000）

食管癌是最常见的胃肠道恶性肿瘤之一，目前尚无有效的治疗方法，发病呈逐年上升趋势[1]。在我国90%以上食管癌病例为鳞状细胞癌亚型，少数为腺癌亚型，且绝大多数食管癌患者确诊时已处于癌症中晚期[2]。目前，食管癌的治疗手段主要有包括手术、放射治疗和化疗等，然而上述治疗措施的临床疗效有限[3]。食管癌复发患者一般会对曾用化疗药物表现出一定程度的耐药性，因此，研发新型高效低毒的食管癌治疗药物是改善当前食管癌治疗困境的一种有效途径。

当前，有关新型天然抗肿瘤药物的开发越来越受到关注[4]。地黄（Rehmannia glutinosa）是玄参科多年生草本植物，有悠久的药用历史。近年来随着提取分离技术的革新，对于地黄的药用价值认识更加透彻[5]。益母草苷（Ajugol）是一种环烯醚糖苷化合物，能从地黄中分离提取，已被证明是多种中药的有效成分[6]，已被证实具有护肝、清热凉血、抗菌功效[7]。该次研究中，采用不同浓度的Ajugol 在体外作用于食管癌TE-1 细胞、Eca-109 和KYSE-150 细胞，通过CCK-8 试剂盒检测Ajugol 对食管癌细胞生长抑制作用。为了进一步探究其抑制细胞增殖作用机制，笔者采用流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率，确定Ajugol 是否通过促进细胞凋亡，影响细胞周期来诱导食管癌细胞死亡，以期为地黄在食管癌的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞及试剂

人食管癌细胞TE-1、Eca-109、KYSE-150 均购于中国科学院细胞库。

Ajugol 试剂购于成都瑞芬思生物技术有限公司，用DMSO（购于上海生物工程技术有限公司），溶解分装后-80℃保存。RPMI-1640 培养基、胎牛血清0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液、青霉素及链霉素双抗均购自Hyclone 公司。CCK-8 试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC 细胞凋亡检测试剂盒、RIPA 裂解液（强）、细胞周期和细胞凋亡检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。

荧光倒置显微镜（CKX41）为Olympus 公司产品，Spectramax190 酶标仪为Molecular Devices 公司产品，流式细胞仪为BD 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养。将TE-1、Eca-109、KYSE-150 细胞培养在加有10%胎牛血清及双抗（青霉素及链霉素）的RPMI-1640 完全培养基中，置于37℃，含5% CO2且箱底有无菌去离子水的恒温培养箱中。所有细胞相关操作均在无菌操作台内进行。

1.2.2 CCK-8 比色法。将生长状态良好的TE-1、Eca-109、KYSE-150 细胞，按3×104/mL的密度接种在96 孔培养板中，待细胞贴壁后，用不同浓度的Ajugo（100、25、6.25、1.56、0.39 μM）处理细胞；以未经任何药物处理的TE-1、Eca-109、KYSE-150 细胞作为空白对照组（Ajugo 0 μM）：以体积分数为0.6% DMSO 处理TE-1、Eca-109、KYSE-150细胞作为对照组，每组均设置3 个复孔。将孔板放入培养箱内药物作用48 h 后取出，在每孔内加入CCK-8 溶液10 μL，放入37℃恒温培养箱内继续培养1 h。取出孔板，使用酶标仪测定各孔吸光度OD 值，波长选择490 nm。用相关软件计算细胞生长的存活率：细胞存活率（%）=（试验组OD值-空白组OD 值）/（试照组OD 值-空白组OD 值）×100%。

1.2.3 流式细胞术检测Ajugol 对细胞凋亡的影响。当10 cm培养皿中的Eca-109 细胞生长融合度为80%时，收集并消化细胞，将大概1×106细胞接种到六孔板中，接种24 h后给予不同处理，试验组加入不同浓度的Ajugol（0、2、4、8 μM），以DMSO 为空白对照，处理结束后将6 孔板放置于37℃恒温培养箱中继续培养48 h。48 h 后吸掉旧的培

养基，加入0.25%胰酶消化细胞，然后收集细胞悬液于离心管内，1 000 rpm，5 min，去掉上清液，以PBS 液洗涤，再次离心，反复操作2 次。用PBS 轻轻重悬细胞并计数，取5 万～10 万重悬的细胞，1 000 rpm，5 min，弃掉上清液，加入195 μL Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。加入5 μL Annexin V-FITC 轻轻混匀之后，再加入10 μL 碘化丙啶染色液，室温（20℃～25℃）避光孵育10～20 min，随后置于冰浴中，上机（BD FACScaliber）检测。

1.2.4 流式细胞术检测Ajugol 对细胞周期的影响。取对数生长期的Eca-109 细胞，将大概1×106细胞接种到六孔板中，接种24 h 后给予不同处理，实验组加入不同浓度的Ajugol（0、2、4 μM），以DMSO 为空白对照，将6 孔板放置于37℃恒温培养箱中继续培养48 h 后，消化收集细胞于离心管中，低温4℃，300 rpm 离心5 min，去上清液，加入2 mL PBS 重悬细胞，低温4℃，300 rpm 离心5 min。细胞固定：去上清液，加入1 mL PBS 重悬细胞，移液器吹打均匀后，轻柔涡旋的同时缓慢加入3 mL 无水乙醇（预冷至-20℃），4℃固定2 h，离心10 min，弃去乙醇。加入5 mL PBS 洗涤细胞，低温4℃，300 rpm 离心10 min，弃去上清液，残留约50 μL 左右的PBS，加入0.5 mL RNaseA 溶液（PBS，200 μg/mL RNaseA）重悬细胞，在37℃放置5～10 min以去除RNA。加入0.5 mL PI 染色液（PBS，100 μg/mL PI），避光37℃孵育15 min，过滤后置冰上，避光，上机（BD FACScaliber）检测。

2 结果与分析

2.1 Ajugol 抑制食管癌细胞的增殖

用不同浓度的Ajugol（0.39、1.56、6.25、25、100 μM）处理TE-1、KYSE-150、Eca-109 细胞48 h 后，采用CCK8 法检测。结合表1、2 及图1 可以看出：在体外试验中，Ajugol对3 种食管癌细胞均有抑制作用，当药物浓度从低浓度至高浓度，生存率呈降低趋势，其抑制作用呈浓度依赖型。

图1 不同浓度Ajugol 对食管癌细胞增殖作用的剂量-效应曲线

表1 CCK-8 法检测不同Ajugol 浓度作用于食管癌细胞的OD 值

2.2 Ajugol 对食管癌细胞凋亡具有促进作用

不同浓度（0、2、4、8 μM）Ajugol 作用于Eca-109 细胞48 h 后，由图2 可见细胞均有不同程度的凋亡，且随着药物的浓度从低到高细胞的凋亡率增加，表明细胞的凋亡率与药物浓度成正相关。Eca-109 细胞各组的凋亡率分别为（3.82±1.31）%、（8.64±1.82）%、（24.28±4.35）%、（70.34±3.85）%，见图2。

图2 不同浓度Ajugol 对Eca-109 细胞凋亡率变化的影响

2.3 Ajugol 使食管癌细胞周期被阻滞在G2/M 期

不同浓度Ajugol（0、2 和4 μM）作用于食管癌细胞48 h 后，结果如图3，FACS 结果显示细胞周期G1，S 期的细胞随着药物浓度的升高，细胞数目出现减少的趋势，即与药物浓度呈负相关，而G2 期细胞随着药物浓度的升高，其细胞数目呈现增加的趋势，表明细胞增殖周期被阻滞在G2/M 期。描述各细胞周期的具体比例变化如表3所示。

表3 Eca-109 细胞周期中各期所占比例 %

图3 不同浓度Ajugol 对Eca-109 细胞周期的影响

表2 CCK-8 检测不同浓度Ajugol 对食管癌细胞生存率的影响 %

3 讨论

食管癌（EC）是癌症发病率世界排名第7、致死率排名第6的一种消化道癌症，由于饮食习惯、环境因素、应激等因素，每年都有更多的人被诊断为食管癌[8]。该次研究发现Ajugol 在体外对食管癌细胞增殖抑制作用呈浓度依赖型。生物体内各种细胞组织通过凋亡与增值来维持体内的平衡，一旦平衡被打破就会导致身体出现很多疾病比如肿瘤癌症等[9]，而抗肿瘤药物可以使细胞出现程序性死亡从而达到治疗肿瘤的效果[10]。该次研究证明Ajugol 作用于食管癌细胞出现不同程度的凋亡且与药物浓度成正相关，并让癌细胞增殖周期被阻滞在G2/M 期。综上所述，Ajugol 表现出较好的抗肿瘤细胞活性。

该次研究加强了人们对传统中药抗癌的认识，如研究已发现地黄可以提高宫颈癌、乳腺癌患者免疫调节机制[11-12]，而地黄中可大量提取Ajugol，为地黄作为抗食管癌的新型药物提供理论依据。后续研究可进一步对Ajugol体内抗癌活性及作用机制探索，并可结合临床放射治疗和化疗技术，探讨中西医结合新疗法，这将为天然植物来源的抗癌药物研发提供新的方向。