分子印迹固相萃取-高效液相色谱法测定牛肉干中苯并(α)芘的含量

◎ 尹安胤

（云南省德宏州质量技术监督综合检测中心，云南 德宏 678400）

苯并芘（Benzopyrene）是一类含苯环的稠环芳烃，根据苯环的稠合位置不同，苯并芘有多种异构体，其中苯并(α)芘（BaP）是最常见的一种，也是多环芳烃中毒性最大的一种强致癌物，是世界卫生组织确定的三大强致癌物（黄曲霉毒素、亚硝胺、苯并芘）之一[1]。苯并(α)芘广泛存在于烟熏、油炸、烧烤、烘焙等食品中，主要是由于食品中的碳水化合物、蛋白质和脂肪在不完全燃烧时产生的[2]。人体长期摄入含并(α)芘的食品会对健康造成巨大威胁，在历年的《国家食品安全监督抽检实施细则》中都将其列为重点检测项目。

火烧牛肉干巴是云南省德宏州傣族人民的一种风味休闲食品，深受当地人们喜爱。牛肉干在加工过程中经炭火高温烤制会产生一定量的苯并(α)芘。GB 2762—2017《食品安全国家标准 食品中污染物限量》规定了肉及肉制品中苯并(α)芘的限量为5.0 μg·kg-1[3]。

目前，苯并(α)芘的检测方法主要采用GB 5009.27—2016《食品安全国家标准 食品中苯并(α)芘的测定》中的高效液相色谱法[4]，其中样品净化处理方法有中性氧化铝柱净化法和分子印迹柱净化法。分子印迹柱净化法是采用分子印迹技术的原理，模拟免疫学中抗原抗体反应模式，将样品中的目标化合物进行特异性提纯处理和富集。由于分子印迹聚合物（MIP）具有从复杂样品中选择性地吸附模板分子的能力，因此它非常适合用作固相萃取剂来分离和富集复杂样品中的痕量被分析物，可有效提高分析的精密度和准确性[5]。本文采用分子印迹固相萃取净化技术结合高效液相色谱法，建立了牛肉干中苯并(α)芘的测定方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20A高效液相色谱仪（RF-20A荧光检测器），日本岛津；XT-NS1全自动定量浓缩仪，上海新拓分析仪器科技有限公司；HS-6150超声波清洗器，天津市恒奥科技有限公司；BS1254电子天平，德国赛多利斯股份有限公司；Maxi Mix II涡旋振荡器，赛默飞世尔科技有限公司；甲醇中苯并(α)芘标准物质（10.0 μg·mL-1），中国计量科学研究院；0.22 μm针式滤膜，天津津腾实验室设备有限公司；二氯甲烷（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯），默克化工技术（上海）有限公司；超纯水机，密理博中国有限公司；中性氧化铝柱（ProElut BAP 22 g/60 mL）、分子印迹柱（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL），迪马科技（天津）有限公司。

1.2 实验样品

牛肉干购自本地超市，生产单位为德宏州本地某食品企业。

1.3 色谱条件

色谱柱：Thermo HYPERSIL Green PAH多环芳烃分析专用柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：35 ℃；流动相：乙腈∶水（88∶12）；进样量：20 μL；荧光检测器激发波长：384 nm，发射波长：406 nm。

1.4 实验方法

1.4.1 样品的提取

准确称取1 g（精确到0.001 g）均匀试样于50.0 mL离心管中，加入5 mL正己烷，旋涡混合1 min，超声10 min，于5 000 r·min-1离心5 min，取上清液于玻璃烧杯中，再加入5 mL正己烷重复提取一次，合并两次上清液。分别用2种BaP专用固相萃取柱进行净化处理。

1.4.2 样品的净化

（1）中性氧化铝柱净化（ProElut BAP 22 g/60 mL）。先用30 mL正己烷活化柱子，弃去流出液并保持湿润。将待净化液全部转移至SPE小柱中，并用2 mL正己烷清洗烧杯并转移至小柱。控制流速，收集净化液于氮吹管中，再加入50 mL正己烷洗脱，继续收集净化液。将净化液在40 ℃浓缩仪中氮吹至干，准确加入1 mL乙腈旋涡复溶，用0.22 μm针式滤膜过滤至色谱进样小瓶中供液相色谱测定，与标准系列比较，外标法定量。

（2）分子印迹柱净化（ProElut BAP-MIP 500 mg/6 mL）。依次加入5 mL二氯甲烷和5 mL正己烷活化柱子，将待净化液转移至SPE小柱，并用2 mL正己烷清洗烧杯并转移至小柱。控制流速，待样液过完后，用6 mL正己烷淋洗柱子，弃去流出液，再加入6 mL二氯甲烷洗脱并收集洗脱液至氮吹管中。将净化液在40 ℃浓缩仪中氮吹至干，准确加入1 mL乙腈旋涡复溶，用0.22 μm针式滤膜过滤至色谱进样小瓶中供液相色谱测定，与标准系列比较，外标法定量。

（3）标准曲线的绘制。确吸取1.0 mL苯并(α)芘标准物质（10.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中并用乙腈定容，配制成1.0 μg·mL-1的中间液，再用乙腈稀释得到0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1、10.0 ng·mL-1和20.0 ng·mL-1的标准系列工作溶液。将工作溶液注入液相色谱中，按照1.3中的色谱条件进行测定，以标准系列工作液的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得到标准曲线回归方程。

2 结果与分析

2.1 净化方法的选择

本文对中性氧化铝柱净化法和分子印迹柱净化法分别从净化分离效果和加标回收率进行了比较，样品色谱图见图1和图2，加标回收率见表1。通过实验得知，分子印迹柱净化法色谱图杂峰较少、峰型对称、基线平稳、回收率高，结果准确可靠，且样品净化过程中操作较为简单快速、有机试剂消耗少，对实验人员和环境较为友好。因此，分子印迹柱净化法优于中性氧化铝柱净化法，是测定牛肉干中苯并(α)芘的首选前处理方法。

图1 中性氧化铝柱净化法样品色谱图

图2 分子印迹柱净化法样品色谱图

表1 中性氧化铝柱和分子印迹柱回收率表

2.2 线性范围、相关系数和检出限

由 图3和 图4知，苯 并（a）芘 浓 度 在0.5～20.0 ng·mL-1范围内呈良好线性关系，苯并（a）芘的标准曲线回归方程为Y=4.307×10-6X+0.288，相关系数r=0.999 6。随试样同时做空白试验，以3倍信噪比计算出检出限为0.2 μg·kg-1。

图3 苯并(α)芘标准色谱图

图4 苯并(α)芘标准曲 线图

2.3 精密度与回收率实验

选取一个加标样品按照分子印迹柱方法净化处理后重复测定6次，根据苯并（a）芘峰面积计算出相对标准偏差（RSD），结果见表2，平均峰面积为318 540，RSD为1.44%。用已知苯并（a）芘含量的牛肉干样品制备3个添加水平的加标样品：1.0 μg·kg-1、5.0 μg·kg-1和10.0 μg·kg-1，每个水平制备6个平行样，按照分子印迹柱净化方法步骤处理后上机测定，分别计算回收率和RSD，结果见表3。平均回收率的范围为90.3%～95.4%，RSD为0.55%～2.36%。

表2 精密度试验结果表

表3 回收率试验结果表

3 结论

本文建立了牛肉干中苯并（a）芘的分子印迹固相萃取-高效液相色谱分析方法，并通过实验比较了分子印迹柱和中性氧化铝柱的净化分离效果及回收率。实验表明，分子印迹固相萃取柱能选择性地识别和富集苯并芘，具有操作简便、快速、有机试剂消耗少、稳定性好、回收率高等优点，能够满足牛肉干中苯并（a）芘含量的快速测定。