丹紫康膝冲剂通过抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路改善膝骨关节炎大鼠关节软骨、血瘀状态的作用研究*

何 花，董大立

（湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是我国40岁以上成年人最重要的致残、致畸原因之一[1]。KOA在中医学中属“痹证”“骨痹”等范畴。痹者，三气杂至，壅闭经络，气血凝滞而血行不畅，故血瘀病机是KOA的致病关键[2]。基于中药具有辨证施治和多靶点治疗的特色，活血化瘀通络药物更有助于改善KOA患者的临床症状和延缓疾病进展。本研究拟通过建立KOA大鼠模型并分离软骨细胞培养，观察“磷酸化核因子B抑制蛋白激酶（phospho-inhibitor of NF-κB kinase，IKK）/核因子B抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）/核因子B（nuclear factor kappa B，NF-B）”信号通路相关因子的变化，并给予丹紫康膝冲剂干预，以阐述该中成药对KOA大鼠滑膜组织IKK/IκB/NF-κB信号通路、炎症因子及血瘀状态的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康8周龄SPF级SD雄性大鼠70只，体质量200～220 g，购自湖南省中医药研究院实验室，动物生产许可证号：SCXK（湘）2016-0002。饲养温度22～25℃，湿度45%～65%，给予标准饲料和饮用水，饲养环境为SPF级，所有实验均按湖南中医药大学第二附属医院医学伦理委员会和国际动物福利标准的指导方针进行[3]，伦理批号：2020-KY-021。

1.2 药品与试剂 丹紫康膝冲剂由湖南中医药大学第二附属医院药剂科提供，方药组成：紫河车，丹参，熟地黄，怀牛膝，补骨脂，巴戟天，桑寄生，土鳖虫，血竭，独活，乳香，白芍，6 g/包，使用时溶于蒸馏水，根据需要配置成相应溶度悬混液；双氯芬酸钠肠溶片（广东华南药业集团有限公司，批号：20150404）；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC，核因子κB抑制剂）（美国Sigma公司，批号：1434953V）；兔抗鼠NF-κB抗体（北京奥森生物有限公司，批号：bs-1704R）；细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司，批号：20160409）；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA检测试剂盒（批号：20170301）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA检测试剂盒（批号：20170715）、低氧诱导因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）ELISA检测试剂盒（批号：20180507）均购自上海赛默生物科技发展有限公司；anti-ColⅡ-IgG、IgG1和IgG2a ELISA试剂盒（北京中杉金桥生物科技有限公司，批号：20170209）；血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA试剂盒（批号：201907）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）ELISA试剂盒（批号：201908）均购自上海西唐公司；白细胞介素（interleukin，IL）-1β ELISA试剂盒（批号：ELK1372）、IL-18 ELISA试剂盒（批号：ELK13170）、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA试剂盒（批号：ELK1458）均购自上海Elabscience公司；NF-κB p65抗体（批号：20170824A）、磷酸化NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗体（批号：20180611A）、NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）抗体（批号：20180509A）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）抗体（批号：20190414A）、磷酸化IκB激酶α（phosphoinhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）抗体（批号：20190920A）、磷酸化IκB激酶β（phospho-inhibitor of NF-κB kinase β，p-IKKβ）抗体（批号：20191123A）、Nod样受体蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）抗体（批号：20180321A）均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要仪器Varioskan LUX型多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型小型垂直蛋白电泳仪（美国Bio-Rad公司）；脱水机、包埋机、组织摊片机（武汉俊杰电子有限公司）；TGL-18R型台式冷冻离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）；病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；载玻片及盖玻片（江苏世态实验器材有限公司）。

1.4 造模与分组 将70只雄性SD大鼠饲养1周后，采用随机数字表法分为假手术组，模型组，双氯芬酸钠组，PDTC组及丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组，每组10只。假手术组大鼠仅模拟手术过程，其余6组大鼠建立KOA模型。根据Hulth法[4]建立膝骨关节炎模型：腹腔注射10%水合氯醛将大鼠麻醉，固定在手术操作台上，沿右侧膝关节内侧入路，充分暴露关节腔，切断前交叉韧带，经“前抽屉试验”验证呈阳性，则建模成功。缝合伤口。术毕，正常饲养，在伤口处涂抹抗生素，以防伤口感染。假手术组大鼠手术过程同模型组，但是不切断前交叉韧带。（见图1）

图1 假手术组和造模组大鼠交叉韧带处理情况

1.5 实验给药 丹紫康膝冲剂成人剂量为0.3 g/kg，按成人（60 kg）与动物体表面积换算公式计算3组大鼠给药剂量，根据低、中、高剂量组用药量比例（1∶2∶4），丹紫康膝冲剂低剂量组大鼠每日剂量为0.15 g/kg（约相当于成人临床日用量按体表面积折算的等效剂量），丹紫康膝冲剂中、高剂量组大鼠以每日0.3、0.6 g/kg的剂量进行灌胃；双氯芬酸钠组大鼠以每日5 mg/kg的剂量给予双氯芬酸钠灌胃；PDTC组以每日100 mg/kg的剂量进行灌胃；而假手术组、模型组分别给予1 mL/kg生理盐水灌胃。1次/d，连续灌胃28 d。

1.6 观察指标

1.6.1 HE组织染色[5]实验结束后，颈椎脱臼处死大鼠，取膝关节软骨组织，常规石蜡包埋，3 μm厚度做组织切片。经苏木素染核和伊红复染，中性树脂封片后观察。

1.6.2 番红-O-固绿组织染色[6]石蜡包埋组织切片方法同上。新鲜配置的Weigert染液染色，在固绿染色液内浸染，加入番红O染色，中性树脂封固后观察。

1.6.3 免疫组化法检测软骨组织NF-κB蛋白表达[7]收集膝关节软骨组织，常规石蜡包埋组织切片。按照试剂盒说明书进行免疫组化染色操作，将兔抗鼠NF-κB抗体按1∶50稀释，观察胞核和胞浆中阳性染色情况。

1.6.4 蛋白免疫印记法检测软骨组织胞核蛋白和胞浆蛋白NF-κB蛋白表达[8]收集新鲜的膝关节软骨组织，迅速放入预冷的研钵中捣碎，分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白，取20 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转至聚偏二氟乙烯膜上，将NF-κB p65抗体和p-NF-κB p65抗体按1∶50稀释，分别孵育过夜，ECL曝光后，对蛋白条带进行扫描。

1.6.5 蛋白免疫印记法检测软骨组织总蛋白IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表达[9]收集新鲜的膝关节软骨组织，提取组织总蛋白，迅速放入预冷的研钵中捣碎，分别提取胞核蛋白和胞浆蛋白，取20 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转至聚偏二氟乙烯膜上，加入IκBα抗体（1∶100稀释）、p-IκBα抗体（1∶250稀释）、p-IKKα抗体（1∶50稀释）、p-IKKβ抗体（1∶300稀释）、NLRP3抗体（1∶50稀释），分别孵育过夜，TBST洗膜，ECL显色，使用凝胶成像仪拍照，以被检蛋白与GAPDH的吸光度比值作为其相对表达水平。

1.6.6 ELISA检测血清炎症因子[10]末次给药后禁食24 h，摘眼球取血，离心分离血清，采用ELISA检测试剂盒测定外周血炎症因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2）、抗-胶原抗体（anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG1和anti-ColⅡ-IgG2a）水平。

1.6.7 ELISA检测血浆TXB2和6-keto-PGF1α水平[11]末次给药后禁食24 h，摘眼球取血，用肝素钠抗凝，离心机沉淀，留取血浆，采用ELISA检测试剂盒测定血浆TXB2和6-keto-PGF1α水平，并计算比值。

1.7 统计学方法 利用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，计量资料均以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和重复测量的方差分析，两组间比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠软骨组织损伤的影响 经HE染色，假手术组大鼠膝关节关节面光滑，软骨滑膜组织完整，细胞排列整齐；模型组大鼠软骨组织可见大量炎症细胞、中性粒细胞、淋巴细胞浸润，而且深部软骨细胞可见明显细胞核压缩，胞质肥大，潮线消失，细胞排列不规则；与模型组比较，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨细胞排列均匀，胞核和胞质逐渐恢复正常。（见图2）

图2 各组大鼠软骨组织HE染色结果 （×100）

经番红-O-固绿染色，假手术组大鼠软骨组织染色均匀，结构清晰；模型组大鼠骨关节面不平，软骨钙化，胶原纤维增生，软骨细胞外基质经番红O染色变浅，染色不均一，而且软骨陷窝结构扩张；与模型组比较，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织番红O稍淡染，潮线逐渐清晰，细胞排列逐渐均匀，尤其是丹紫康膝冲剂高剂量组大鼠软骨组织改善明显。（见图3）

图3 各组大鼠软骨组织番红-O-固绿染色结果 （×100）

2.2 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠软骨组织NF-κB蛋白核转位的影响 经免疫组化分析，假手术组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白主要定位于细胞质中，胞核中的表达量相对较少；模型组和双氯芬酸钠组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白主要浓集于胞核区；而PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白发生核转移的数量明显减少，主要定位于细胞质中，尤其是丹紫康膝冲剂高剂量组和PDTC组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白核转移的数量明显少于丹紫康膝冲剂低、中剂量组。（见图4）

图4 各组大鼠软骨组织NF-κB蛋白在软骨细胞中的定位情况 （免疫组化，×100）

2.3 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠软骨组织NF-κB蛋白核表达的影响定量分析 与假手术组比较，模型组、双氯芬酸钠组、丹紫康膝冲剂低剂量组、丹紫康膝冲剂中剂量组、丹紫康膝冲剂高剂量组和PDTC组大鼠软骨组织胞核和胞浆中NF-κB蛋白表达量均明显升高（P<0.05）。与模型组比较，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组和PDTC组大鼠软骨组织胞核和胞浆中NF-κB蛋白表达量均明显降低（P<0.05或P<0.01），尤其是丹紫康膝冲剂高剂量组和PDTC组大鼠软骨组织NF-κB蛋白变化更明显（P<0.01）。与双氯芬酸钠组比较，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织胞浆中NF-κB蛋白表达量和丹紫康膝冲剂高剂量组大鼠软骨组织胞核中NF-κB蛋白表达量均明显降低（P<0.05）。与PDTC组比较，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织胞核中NF-κB蛋白表达量均明显升高（P<0.05）。（见表1、图5）

图5 Western blotting法检测胞核和胞浆中NF-κB蛋白的表达情况

表1 各组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白表达情况比较

表1 各组大鼠软骨组织中NF-κB蛋白表达情况比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05，cP<0.01；与双氯芬酸钠组比较，dP<0.05；与PDTC组比较，eP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 胞浆NF-κB/GAPDH 胞核NF-κB/LaminB1假手术组 10 -模型组 10 -双氯芬酸钠组 10 5 mg/kg丹紫康膝冲剂低剂量组 10 0.15 g/kg丹紫康膝冲剂中剂量组 10 0.3 g/kg丹紫康膝冲剂高剂量组 10 0.6 g/kg PDTC组 10 100 mg/kg 0.02±0.01 0.39±0.05a 0.31±0.04a 0.10±0.03abd 0.12±0.05abd 0.08±0.01abcd 0.09±0.01abc 0.74±0.07 1.87±0.20a 1.65±0.17ab 1.76±0.18ae 1.62±0.15abe 1.19±0.12abcde 0.88±0.13abc

2.4 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠软骨组织总蛋白p-IκBα、IκKα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβ、NLRP3蛋白表达的影响与假手术组比较，模型组，双氯芬酸钠组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）。与模型组比较，双氯芬酸钠组，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组和PDTC组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）。与双氯芬酸钠组比较，丹紫康膝冲剂中剂量组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKβ和丹紫康膝冲剂高剂量组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相对表达量均明显降低（P<0.05）；与PDTC组比较，丹紫康膝冲剂中、高剂量组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05），丹紫康膝冲剂低剂量组大鼠软骨组织p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）。6组大鼠软骨组织IκBα、IKKα、IKKβ蛋白相对表达量比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（见表2、图6）

表2 各组大鼠软骨组织中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表达比较

表2 各组大鼠软骨组织中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表达比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与双氯芬酸钠组比较，cP<0.05；与PDTC组比较，dP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 p-IκBα IκBα p-IKKα IKKα p-IKKβ IKKβ NLRP3假手术组 10 -模型组 10 -双氯芬酸钠组 10 5 mg/kg丹紫康膝冲剂低剂量组 10 0.15 g/kg丹紫康膝冲剂中剂量组 10 0.3 g/kg丹紫康膝冲剂高剂量组 10 0.6 g/kg PDTC组 10 100 mg/kg 0.03±0.01 0.47±0.02a 0.30±0.02ab 0.33±0.03abd 0.20±0.04abcd 0.18±0.03abcd 0.15±0.02ab 1.23±0.08 1.18±0.15 1.25±0.16 1.21±0.20 1.26±0.18 1.23±0.24 1.22±0.19 0.31±0.03 0.79±0.06a 0.50±0.05ab 0.57±0.04abd 0.50±0.03abd 0.42±0.02abcd 0.28±0.03b 2.31±0.16 2.24±0.29 2.38±0.30 2.40±0.27 2.37±0.28 2.39±0.40 2.44±0.42 0.11±0.02 0.48±0.09a 0.30±0.03ab 0.27±0.04abd 0.22±0.03abcd 0.20±0.02abcd 0.10±0.01b 1.45±0.11 1.39±0.14 1.48±0.22 1.40±0.15 1.43±0.12 1.42±0.10 1.45±0.13 0.54±0.08 0.87±0.08a 0.59±0.05ab 0.85±0.05ad 0.80±0.03abd 0.64±0.05ab 0.72±0.07abc

图6 Western blotting法检测软骨组织中IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表达情况

2.5 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠炎症状态的影响 与假手术组比较，模型组，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明显升高（P<0.05）。与模型组比较，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明显降低（P<0.05）。与双氯芬酸钠组比较，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明显升高（P<0.05）；与PDTC组比较，丹紫康膝冲剂高剂量组大鼠外周血IL-1β、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG水平均明显降低（P<0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠外周血清细胞因子水平比较

表3 各组大鼠外周血清细胞因子水平比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与双氯芬酸钠组比较，cP<0.05；与PDTC组比较，dP<0.05

动物数 IL-1β IL-18 TNF-α Anti-ColⅡ(OD) HIF-1a NO PGE2（只） (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) IgG IgG1 IgG2a (ng/L) (μmol/L) (ng/L)假手术组 10 -模型组 10 -双氯芬酸钠组 10 5 mg/kg丹紫康膝冲剂低剂量组10 0.15 g/kg丹紫康膝冲剂中剂量组10 0.3 g/kg丹紫康膝冲剂高剂量组10 0.6 g/kg PDTC组 10 100 mg/kg组别 给药剂量6.57±3.10 27.41±7.65a 10.36±3.48ab 25.33±3.21acd 21.05±3.79abcd 16.59±3.21abcd 19.70±4.25abc 1.33±0.24 6.77±1.49a 2.19±0.43ab 6.18±0.59abcd 6.02±0.47abcd 4.76±0.55abc 3.49±0.56abc 0.78±0.27 2.61±0.45a 0.96±0.34ab 2.51±0.48acd 2.26±0.29abcd 1.72±0.35abcd 2.04±0.62abc 1.31±0.03 1.90±0.07a 1.48±0.05ab 1.87±0.06a 1.85±0.10a 1.57±0.05abcd 1.82±0.04ab 0.78±0.03 0.75±0.02 0.76±0.01 0.74±0.02 0.77±0.05 0.74±0.02 0.77±0.03 0.53±0.02 1.20±0.04a 0.72±0.03ab 1.14±0.03abc 1.02±0.02abc 0.97±0.04abc 1.04±0.03abc 2189.47±697.32 4916.56±1374.25a 2954.83±729.46ab 4470.53±931.74acd 4055.12±799.21abc 3412.47±668.59abcd 4032.58±1285.97abc 17.40±2.81 35.40±4.16a 21.45±3.13ab 32.20±2.89abcd 31.77±3.65abcd 24.82±3.46abcd 27.33±4.27abc 105.69±18.72 187.67±24.75a 129.32±23.29ab 160.64±19.55abcd 151.30±25.38abcd 133.26±17.64abcd 180.94±19.62bc

2.6 丹紫康膝冲剂对KOA大鼠血瘀状态相关因子的影响 与假手术组比较，模型组，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠血浆TXB2含量明显升高，6-keto-PGF1a含量明显降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明显升高（P<0.05）。与模型组比较，双氯芬酸钠组，PDTC组和丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠血浆TXB2含量明显降低，6-keto-PGF1a含量明显升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明显降低（P<0.05）。与双氯芬酸钠组比较，丹紫康膝冲剂低、中剂量组大鼠血浆TXB2含量明显升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明显升高（P<0.05）。与PDTC组比较，丹紫康膝冲剂低剂量组大鼠血浆TXB2含量明显升高，6-keto-PGF1a含量明显降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明显升高（P<0.05）；丹紫康膝冲剂高剂量组大鼠血浆TXB2含量明显降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明显降低（P<0.05）。（见表4）

表4 各组大鼠外周血浆TXB2和6-keto-PGF1a水平比较

表4 各组大鼠外周血浆TXB2和6-keto-PGF1a水平比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05；与双氯芬酸钠组比较，cP<0.05；与PDTC组比较，dP<0.05

组别 动物数（只） 给药剂量 TXB2（ng/L） 6-keto-PGF1a（pg/mL） TXB2/6-keto-PGF1a假手术组 10 -模型组 10 -双氯芬酸钠组 10 5 mg/kg丹紫康膝冲剂低剂量组 10 0.15 g/kg丹紫康膝冲剂中剂量组 10 0.3 g/kg丹紫康膝冲剂高剂量组 10 0.6 g/kg PDTC组 10 100 mg/kg 176.44±34.10 279.61±37.65a 206.35±35.48ab 264.11±25.73abcd 236.29±28.64abcd 203.59±40.21abd 248.70±41.35abc 61.33±0.97 53.72±1.49a 55.19±1.03ab 55.16±1.18ab 55.25±0.92ab 55.89±1.17ab 56.49±3.56ab 2.88±0.19 5.20±0.67a 3.55±0.32ab 4.92±0.81abcd 4.26±0.86abc 3.46±0.38abd 4.40±0.54abc

3 讨 论

中医学认为膝骨关节炎发病与肝肾亏虚，风、寒、湿及瘀血客于局部有关，因局部气滞血瘀，经脉痹阻不通而发病[12]。膝骨关节炎属“痹证”范畴，肾虚、血瘀是“痹证”的主要病因，其病机肾虚为本，血瘀为标，因此中医在治疗痹证上，根据辨证，合理运用活血化瘀、祛风除湿、补益肝肾等药物[13]。丹紫康膝冲剂是我院治疗OA的经验方，具有补肝益肾、活血通络、柔肝止痛之功效[14]。经多年临床研究证实，该方配伍精当，正中病机。此外，该方剂中丹参、土鳖虫、血竭可活血化瘀，但是对于改善患者血瘀状态的研究甚少，为临床推广带来了一定的局限性。

在本研究中，我们建立KOA大鼠模型后，经软骨组织病理观察证实，丹紫康膝冲剂可以显著改善大鼠软骨组织的损伤状态，而且其疗效与非甾体类抗炎药物双氯芬酸钠基本一致。从作用机制分析，该方剂对于IKK/IκB/NF-κB信号通路具有一定的抑制作用。NF-κB是参与机体炎症反应、免疫调节、细胞凋亡等过程的重要转录因子，可在胞质中与NF-κB抑制蛋白（如IκBα）结合，形成无活性聚合体；而IKK是促进胞质IκBα蛋白磷酸化的重要上游激酶，可导致NF-κB蛋白发生核转位，增强某些靶基因的转录。IKK/IκB/NF-κB信号通路激活后可诱导大量细胞因子如IL-1β、IL-18、TNF-α等大量分泌，造成软骨损伤。此外，NLRP3炎症小体在IKK/IκB/NF-κB信号通路激活过程中发挥着协同作用。在本研究中，丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠软骨组织中p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白表达量均明显低于模型组，且NF-κB核转位减弱，尤其是丹紫康膝冲剂高剂量组改善最明显，说明丹紫康膝冲剂对于IKK/IκB/NF-κB信号通路具有一定的抑制作用。此外，谈冰等[15]证实NF-κB信号通路激活是OA患者凝血异常的原因之一。一方面NF-κB的激活可促进内皮细胞黏附分子的表达，另一方面可通过促进促炎因子的分泌，进一步放大血小板聚集、活化。在本研究中，我们发现丹紫康膝冲剂低、中、高剂量组大鼠血浆TXB2/6-keto-PGF1a比值均低于模型组，且逐渐恢复至假手术组大鼠状态。

综上所述，丹紫康膝冲剂不仅可抑制KOA大鼠的炎症反应，减轻软骨组织病理损伤，同时也可有效改善大鼠的血瘀状态，其作用机制之一与抑制IKK/IκB/NF-κB信号通路的活化有关。在本研究中，我们通过Hulth法建立的大鼠模型证实了丹紫康膝冲剂对骨关节炎的治疗作用部分依赖于对IKK/IκB/NF-κB信号通路的抑制，但不能完全阐明丹紫康膝冲剂治疗膝骨关节炎的作用机制。在后续的研究中，我们将构建更多的动物模型，并从体外细胞层面和动物实验两方面进一步证实丹紫康膝冲剂的药理作用，并综合分析其作用机制，为丹紫康膝冲剂的临床应用提供更可靠的实验证据。