单丛茶HS-SPME/GC-MS 指纹图谱的构建

卢丹敏，唐俊伟，张天天，欧阳建，叶汉钟，林镇填，刘仲华,*，黄建安,*

（1.湖南农业大学茶学教育部重点实验室，湖南长沙 410128；2.国家植物功能成分工程技术研究中心，湖南长沙 410128；3.植物功能成分利用省部共建协同创新中心，湖南长沙 410128；4.宋凰生态茶业有限公司，广东潮州 521000；5.潮州市天羽茶业有限公司，广东潮州 521000）

单丛茶（凤凰单丛、岭头单丛）是一种传统名茶，产自广东潮州，以浓郁多变的花果蜜香和浓醇的滋味品质著称。它是用2～4 叶、芽叶完整的对夹叶，经过采摘、晒青、摊凉、碰青、杀青、揉捻、烘焙等工艺加工而成[1−2]。单丛茶叶因其品种和工艺参数不同，其品质特点也不尽相同。根据香型可分为黄枝香、芝兰香、玉兰香、蜜兰香、杏仁香、姜花香、肉桂香、桂花香、夜来香、茉莉香、柚花香、橙花香、杨梅香等十几种产品[3−4]。

目前有多种方式可对茶叶中的挥发性物质进行提取，包括同时蒸馏萃取法[5]、超临界流体萃取法[6]、顶空固相微萃取法[5,7]和溶剂辅助风味蒸发法[8−9]等。由于顶空固相微萃取法具有需样量较小、处理时间较短、能收集样品中绝大部分挥发性成分等优点[10−11]，现已成为茶叶挥发性提取的常用方法。目前，指纹图谱借鉴了法医学的概念，在重视个体差异性的基础上，强调重视群体的共性，以期综合反映各物质成分含量的真实性、稳定性和均一性[12]。现阶段，茶叶指纹图谱主要利用各种色谱、光谱、波谱等手段构建，包括气相色谱法[13]、紫外光谱法[14]、红外光谱法[15−16]、核磁共振法[17−18]、高效液相色谱法（HPLC）[12,19−21]和气质联用法[22−23]等。在挥发性物质方面，与气相指纹图谱相比，气质联用技术指纹图谱具有灵敏度更高、准确度更高和重现性更好等优点，近年来也被广泛应用于茶叶鉴定和质量控制中。WU 等[22]利用GC-MS 指纹图谱，结合主成分、聚类分析方法和指纹相似度分析，成功区分和识别来自云南省两个茶山的普洱茶。LONG 等[23]通过判别分析，可以将样品分为7 个不同的组，建立了七个不同等级的信阳毛尖香气成分的GC-MS 指纹图谱，为信阳毛尖等级判别提供了一种新方法。

目前，在单丛茶挥发性物质指纹图谱方面还未有相关研究。另一方面，单丛茶鉴别的方法仍依赖于评茶师的经验及其个人感受，依国标[24]或行标[3−4,25]进行评判，这种方法受个人喜好及身体状况的影响，一定程度上导致市面上的单丛茶鱼龙混杂。因此，本文对单丛茶进行顶空固相微萃取的条件优化研究，并对各个样品进行GC-MS 检测和分析。尝试为单丛的挥发性物质检测提供操作方便、准确率高的萃取方法；建立单丛茶挥发性物质指纹图谱以及建立基于指纹图谱数据的地区判别函数，为单丛茶的产地判别及真伪鉴别等提供科学的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

22 个单丛茶样（D1～D22）均为2019 年茶叶出自潮州当地饶平和凤凰两个地区，D1～D8 为饶平地区茶叶，D9～D22 为凤凰茶区茶叶。样品收集后于阴凉干燥处保存；氯化钠 国药集团化学试剂有限公司；癸酸乙酯 美国 Sigma-Aldrich 试剂公司；C8～C40 偶数正构烷烃标准品 美国 o2si 公司。

样品瓶15 mL 上海安谱科学仪器有限公司；EPFO-984TA7CHSEUA 数显型磁力加热搅拌器美国 Talboys 公司；7890B-5977A 气相色谱质谱联用仪 美国 Agilent 公司；固相微萃取手动进样手柄、PDMS/DVB 固相微萃取头65 μm 美国Supelco公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品处理 采用五点取样法对茶样进行取样、合并和磨碎，而后在每个茶样中各取3.0 g 磨碎样进行混合作为条件优化试验样本QC，置于干燥器中常温保存。

1.2.2 顶空固相微萃取条件 采用单因素逐步优化的方法对凤凰单丛茶挥发性成分顶空固相微萃取条件进行优化。在萃取温度为80 ℃和茶水比0.75 :5 g/mL 的条件下，分别萃取30、40、50 和60 min以此考察萃取时间对萃取效果的影响；在萃取时间为40 min 和茶水比0.75 : 5 g/mL 的条件下，分别在60、80、90 和100 ℃的电子磁力加热搅拌器上萃取，以此考察萃取温度对萃取效果的影响；在萃取时间40 min 和萃取温度80 ℃的条件下，考察茶水比0.5:5、0.75:5、1:5、1.25:5 g/mL 对萃取效果的影响，通过比较因素中各水平的总峰面积和峰个数衡量萃取效果，最终确定最优萃取参数。

1.2.3 萃取过程 在放有QC 样本和磁力转子的15 mL样品瓶中，迅速加入带有10 μL 癸酸乙酯内标（8.64 mg/L）和0.5 g 氯化钠的5 mL 沸水，用带有聚四氟乙烯隔垫的瓶盖拧紧，摇匀，然后置于一定温度和转速（600 r/min）的磁力搅拌加热器上，搅拌加热。5 min 平衡后将老化过的萃取纤维头推出，纤维头距离液面0.5 cm，进行挥发性物质萃取。一定时间后收回纤维头，迅速插入进样口中进行解析，每个条件重复3 次。

1.2.4 GC/MS 分析条件 参考李永迪、肖凌等[7−8]分析茶叶挥发性成分的方法，适当调整后的条件如下：

GC 条件：色谱柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为氦气（纯度>99.999%），进样口温度250 ℃，柱流速1 mL/min，进样方式为脉冲不分流；升温程序：40 ℃（6 ℃/min 上升）→80 ℃（1.5 ℃/min上升）→100 ℃（6 ℃/min 上升，保持1 min）→130 ℃（6 ℃/min 上升）→150 ℃（3 ℃/min 上升）→165 ℃（15 ℃/min 上升）→230 ℃（保持2 min），溶剂延迟3 min。所有样品重复3 次

MS 条件：离子源EI，离子源温度230 ℃，接口温度250 ℃，EI 源能量70 eV，四级杆温度150 ℃，扫描方式为全扫描模式（scan）：扫描范围35～450 u。谱库: NIST 17。

1.3 数据处理

对GC-MS 检测得到的数据进行解谱，与NIST17标准谱库比对，筛选出匹配度大于75%的物质；为了得到挥发性化合物的保留指数RI 值，在相同条件下检测正构烷烃（C8～C40）。保留指数计算公式如下：

式中：RI 为挥发性化合物的保留指数；n 为该化合物前一碳标的原子数；RTx 为该化合物的保留时间；RTn 为该化合物前一碳标的保留时间；RTn+1 为该化合物后一碳标的保留时间。计算后保留指数RI，查找和比对相关质谱资料中对应物质的保留指数，最终确定物质成分。

以内标峰癸酸乙酯的峰面积和保留时间作为参照，计算各共有峰的相对峰面积和相对保留时间。

本研究应用Excel 和IBM SPSS Statistics 23.0进行数据处理、相似度分析和判别分析，并由Origin 2018 软件绘图完成。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 萃取时间的选择 在同一萃取温度和茶水比的条件下，分别萃取30、40、50 和60 min，结果如图1（A）所示。增加顶空固相微萃取的时间，单丛茶挥发性成分的总峰面积和峰个数呈先增加后减少的趋势。萃取时间30 min 的总峰面积显著（P<0.05）少于萃取40 min 的总峰面积，而萃取40 min 的总峰面积显著（P<0.05）少于50 min，萃取60 min 的总峰面积和40、50 min 无显著性差异（P<0.05）。当萃取时间从30 min 增加至40～60 min，整个过程峰个数均无显著差异（P<0.05）。这说明萃取在50 min 时，纤维头吸附与解吸基本达到平衡。而随着萃取时间的延长，更多大分子物质着附在纤维头上，这使得纤维头上小分子物质的种类和浓度会有所降低[26]。故综合单丛挥发性物质含量和种类的检测结果，选择萃取时间为50 min 进行萃取比较合适。

图1 萃取时间、温度及茶水比对单丛茶挥发性物质萃取的影响Fig.1 Effects of extraction time, temperature and tea-water ratio on volatile components extraction of Dancong tea

2.1.2 萃取温度的选择 在同一萃取时间和茶水比的条件下，分别在60、80、90 和100 ℃的电子磁力加热搅拌器上萃取，结果如图1（B）所示。在萃取温度为60～100 ℃的范围内，随着萃取温度的上升，单丛挥发性成分的总峰面积呈先增加后减少的趋势，而峰种类在上升到一定数量后趋于稳定。从60 ℃升至80 ℃或者从80 ℃升至90 ℃时，总峰面积增加但差异不显著（P<0.05），峰个数显著（P<0.05）增加。90 ℃的总峰面积高于100 ℃，而90 ℃的峰个数少于100 ℃，但这两个萃取温度之间的差异不显著（P<0.05）。萃取温度能直接影响纤维头对挥发性物质的吸附。温度过低则会加长纤维头吸附解吸达到平衡的时间，温度过高则会使样品瓶中分子热运动加快，从而减少小分子物质的吸附浓度，且温度过高会加快挥发性物质的氧化[27]。故综合单丛挥发性物质含量和种类的检测结果，选择萃取温度为90 ℃进行萃取比较合适。

2.1.3 茶水比的选择 在15 mL 样品瓶中分别加入0.5、0.75、1 和1.25 g 的QC 样品，加入5 mL 沸水及转子，在同一萃取温度和时间的条件下萃取，结果如图1（C）所示。随着茶水比的增加，单丛挥发性成分的总峰面积和峰个数呈先增加后减少的趋势。在茶水比为0.75:5 g/mL 时，总峰面积和峰个数达到最高，它与茶水比为0.5:5 g/mL 的结果无显著性差异（P<0.05）；茶水比为0.75:5 g/mL 的峰面积显著（P<0.05）高于茶水比为1:5 g/mL，峰个数二者差异不显著（P<0.05）。茶水比为1:5 g/mL 与茶水比为1.25:5 g/mL 样品量的峰面积和峰个数结果无显著性差异（P<0.05）。合适的样品量能使纤维头在样品瓶中有最大的吸附量，若磨碎样品量过少则多余的水会使液面上方的顶空体积减小，而量过多，则会有一部分没有被水浸没，覆盖在充分浸湿的样品上，影响挥发性物质的挥发。故选择样品量为0.75 g，加入5 mL 沸水进行萃取比较合适。

按照上述萃取条件优化的结果，对各个单丛样品进行GC-MS 分析，共检测出73 个挥发性化合物，主要包括醇类、酮类、醛类、酯类、酚类、碳氢化合物、含氮化合物、杂氧化合物等八类化合物。

2.2 共有峰确认及相对峰面积

按照优化后的HS-SPME/GC-MS 条件对22 个单丛茶挥发性成分进行检测，鉴定各样本色谱图中的挥发性物质后进行比对筛选。最终筛选出20 个具有相同保留时间且鉴定为同一物质的色谱峰作为共有峰（x1～x20）。按保留时间先后顺序依次为1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、α-松油烯、3-异丙基甲苯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、脱氢芳樟醇、α-松油醇、水杨酸甲酯、臧红花醛、癸醛、β-环柠檬醛、香叶醇、吲哚、α-紫罗酮、香叶基丙酮、β-紫罗酮、雪松醇、邻苯二甲酸二异丁酯，如表1 所示。这些物质大多都具有明显的花果香特性，区别于其他茶类主要挥发性物质[28]，构成了单丛茶香气的基本特点。

各共有峰的相对保留时间偏差较小，表明它们在GC-MS 色谱图中具有相对稳定性（见表1）；通过各共有峰的相对峰面积制作挥发性物质热度图（图2），通过该图，可以更直观的看出各共有的挥发性成分间的差异以及样品间的差异。总体来说，峰面积较大的挥发性共有物质为脱氢芳樟醇、芳樟醇、氧化芳樟醇I、吲哚和香叶醇；1-辛烯-3-醇、α-紫罗酮、α-松油烯、邻苯二甲酸二异丁酯的峰面积则较小。

图2 共有挥发性物质含量在各单丛样品间的热度图Fig.2 Heat map of the common volatile substances across each sampleof Dancong tea

各样本非共有峰面积占比在36.7%～58.6%之间，平均占比为45.6%，占比较大，其原因在于单丛香型多变，各样本挥发性成分种类多且杂，在某些特殊香型单丛中无法检测到一些峰面积较大的物质，这也是造成共有物质种类较少的原因。

2.3 相似度分析

以模拟的数字化指纹图谱（表1）做为参照，采用夹角余弦法和皮尔逊相关系数法对各色谱图进行相似度分析，结果如表2 所示。其中有D16 和D21 为姜花香、桂花香品种茶叶，其挥发性成分含量与多数样品差异明显。茶叶挥发性物质组成复杂，不同香型的单丛茶具有相同的主成分，但是各成分比例却不尽相同，造成了千变万化的凤凰单丛香型。相比蜜兰香、黄枝香等单丛茶，这两种香型的单丛茶为小产量品种茶。若除去这两个样本，其余20 个图谱的夹角余弦法结果在0.917～0.995 之间，皮尔逊相关系数法的结果在0.905～0.996 之间，两种算法所得相似度结果较为一致，均大于0.9，符合指纹图谱的要求。据此建立了单丛茶挥发性物质的GC-MS 指纹图谱（图3）。

图3 单丛茶挥发性物质GC-MS 指纹图谱Fig.3 GC-MS fingerprints of volatile components for Dancong tea

表1 单丛挥发性共有物质数字化指纹图谱Table 1 Digitalvolatile common componentsfingerprint chromatogram of Dancong tea

表2 单丛茶挥发性物质指纹图谱的相似度分析Table 2 Similarity analysis of the volatile substancesfingerprint chromatogram for Dancong tea

2.4 判别分析

将单丛茶挥发性成分中的20 个共有峰相对峰面积作为特征，将单丛总样本按3:1 的比例随机分为分析组和验证组。其中分析组17 个样本，用于构建地区判别模型；验证组5 个样本，用于对所建模型的检验（表3）。以17 个样本的20 个共有峰的相对峰面积为原始数据，建立典型判别函数如下：

F=0.556x1−15.633x2+6.298x3−10.964x4+10.763 x5+15.865x6−1.169x7+3.269x8−4.015x9−7.864x10+10.653x11−2.477x12−7.188x13+9.845x14−7.323x18

由于变量x15、x16、x17、x19和x20与判别函数之间的相关性较大，因而不纳入到该典型判别式函数，该函数F 的特征值为100.562，贡献率为100%。

用自身验证法、外源验证法和交互验证法对该典型函数判别模型的准确性进行检验（表3）。自身验证法和交叉验证法的准确率均达100%。将5 个验证组样本代入判别函数F中进行检验，有1 个饶平地区茶样被错判，凤凰地区茶样判对率100%，外部验证正确分类率为80%，表明应用该判别模型将两个地区茶叶分开来是可行的。

表3 不同地区单丛茶判别验证结果Table 3 Results obtained for Dancong tea classification in different regions by discrimination analysis

3 结论

据报道HS-SPME 提取挥发性物质，主要受到样品中挥发性物质浓度、萃取时间和温度等因素的影响，这三者均通过影响分子物质的挥发及在萃取纤维头的着附情况影响萃取结果[10−11]。本文采用单因素研究方法对这三方面单丛茶顶空固相微萃取的条件进行优化研究，最终发现采用萃取时间为50 min、萃取温度为90 ℃、茶水比为0.75:5 g/mL 的条件进行萃取，单丛茶挥发性物质含量和种类萃取效果最好。利用顶空固相微萃取结合GC-MS 方法检测单丛茶挥发性物质，操作方便、灵敏度高，分析速度快、准确率高，具有一定的可行性和优越性，为单丛茶的挥发性物质检测方法提供了高效、节能的分析方法。此外，萃取效果还受萃取纤维头材质的影响，不同的材料吸附各种香气化合物的能力均不同。盐的加入可以起到盐析作用，不同的盐浓度影响挥发性物质的离子强度从而影响萃取效果。另外解析时间、温度及进样模式均能影响检测结果从而影响萃取效果的分析[29]。因此还可以从以上几方面进行研究顶空固相微萃取条件，使方法更系统更科学。

单丛茶（凤凰单丛、岭头单丛）主要产自于广东潮州潮安区和饶平县内特定生长区域，依赖得天独厚的地理环境和自然条件，经过特殊复杂的工艺加工而成，成为了具有区域特色的国家地理标志保护产品。采用GC-MS 检测分析技术从22 个单丛样品中确定了20 个共有峰，分别为1-辛烯-3-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮、（E,E）-2,4-庚二烯醛、α-松油烯、3-异丙基甲苯、氧化芳樟醇I、芳樟醇、脱氢芳樟醇、α-松油醇、水杨酸甲酯、臧红花醛、癸醛、β-环柠檬醛、香叶醇、吲哚、α-紫罗酮、香叶基丙酮、β-紫罗酮、雪松醇、邻苯二甲酸二异丁酯。在潮州地区，传统的茶叶生产者单株选育，单株采制，在历代沿习下，孕育了数量繁多、类型丰富的茶树种质资源，加上当地气候温和，雨量充沛的自然条件使得单丛茶挥发性成分种类比例复杂，香型多变[30−31]。因此建立单丛茶挥发性物质指纹图谱，发现其相似度可达0.9 以上，该结果可为单丛茶的共有物质成分鉴别研究提供理论支持。目前关于单丛挥发性成分指纹图谱的研究较少，本研究由于样品限制仅建立潮州地区单丛茶总指纹图谱，此外，还可从各类香型、各种季节等方面对单丛挥发性指纹图谱进一步展开研究。本实验基于指纹图谱共有峰数据对潮州两个地区的单丛茶进行判别分析，其自身验证法和交叉验证法的正确率均为100%，外部验证正确分类率为80%。潮安和饶平两个地区茶叶品质差异主要与茶叶品种、土质状况、海拔地形以及天气条件密切相关。潮安区茶叶主要产自凤凰镇凤凰山，以生产凤凰单丛为主，其品种香型多变，品质风格独特[31]；饶平县茶叶主要产自浮滨镇岭头村双髻娘山，以生产岭头单丛为主，其品种为白叶品种，香型以蜜兰香为主[32]。该结果可为单丛茶地区鉴别提供科学参考。