白芍总苷对胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用研究

易良波，杨菲菲，易忠禄

（1.赤峰学院附属医院，内蒙古 赤峰 024000；2.红山区西城办事处西南地村卫生室，内蒙古 赤峰 024000）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一种侵袭性高、恶性程度高的消化道肿瘤，早期症状隐匿，确诊时多为中晚期，且预后较差。目前针对胰腺癌的手术、放疗、化疗及对症支持治疗等治疗方法效果均不理想[1-2]。因此寻求新的治疗药物是目前胰腺癌相关研究的热点。

白芍总苷（total glucosides of paeony，TGP）是从白芍根中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化、肝保护和免疫调节等作用，已被用于治疗类风湿关节炎[3-4]。近年来关于白芍总苷抗肿瘤的研究显示，白芍总苷对前列腺癌细胞、胃癌细胞、肝癌细胞增殖、迁移和侵袭具有抑制作用[5-7]，但目前关于白芍总苷对人胰腺癌的研究较少，且相关的机制还值得进一步探究。本研究旨在探讨白芍总苷对人胰腺癌细胞ASPC-1增殖、迁移和侵袭的影响，以期为临床治疗胰腺癌提供实验依据。

1 材 料

1.1 细胞 人胰腺癌细胞ASPC-1细胞系，货号：SUER0463（XR），购于上海素尔生物科技有限公司。

1.2 药物与试剂 白芍总苷胶囊（宁波立华制药有限公司，批号：091102）；RPMI-1640（货号：12633012）、胎牛血清（货号：16140071）（美国Gibco公司）；CCK8细胞增殖检测试剂盒（货号：E606335）、Trizol（货号：B511311）、一步法反转录荧光定量试剂盒（货号：B639277）、结晶紫（货号：A600331）（上海生工生物公司）；兔抗人PCNA单克隆抗体（货号：ab92552）、兔抗人MMP-2单克隆抗体（货号：ab92536）、兔抗人MMP-9单克隆抗体（货号：ab76003）、兔抗人β-actin单克隆抗体（货号：ab115777）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（货号：ab6721）[艾博抗（上海）贸易有限公司]。

2 方 法

2.1 细胞培养 人胰腺癌细胞ASPC-1在含有1%链霉素（100 mg/mL）、青霉素（10 000 U/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中于37℃、5%CO2的培养箱中常规培养。

2.2 白芍总苷溶液的制备 白芍总苷胶囊用二甲基亚砜（DMSO）溶解分别配制成质量浓度为6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液。

2.3 CCK8实验检测细胞毒性 取对数生长期ASPC-1细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期细胞，细胞计数以5000个/孔接种于96孔板中，总体积为100μL，实验组分别加入白芍总苷终质量浓度为0、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液，每组设置3个复孔，培养24h后，弃培养基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波长为450 nm下测定吸光度OD值。

2.4 CCK8实验检测细胞增殖 取对数生长期ASPC-1细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化对数生长期细胞，细胞计数以3000个/孔接种于96孔板中，总体积为100μL，实验设空白对照组、白芍总苷低剂量组、白芍总苷中剂量组、白芍总苷高剂量组，分别加入终质量浓度为0、25、50、100μg/mL的白芍总苷溶液，每组设置3个复孔，分别培养24、48、72 h后弃培养基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波长为450 nm下测定吸光度OD值。

2.5 平板克隆实验检测细胞增殖 将对数生长期ASPC-1细胞，以500个/孔接种于6孔培养板中。组别和复孔的设置如方法“2.4”，培养48 h，观察细胞克隆形成的数量，拍照并计数。实验重复3次。

2.6 细胞划痕实验检测细胞迁移 取对数生长期ASPC-1细胞加入孔板中，每孔背后含有5条横线并含有5×105个细胞。过夜培养后，用200μL的枪头垂直于背后的横线划痕，洗去划下的细胞。组别和复孔的设置如方法“2.4”，培养24 h后，取样拍照。实验重复3次。

2.7 Transwell小室实验检测细胞侵袭 在下室加500μL RPMI-1640（15%小牛血清）培养基和50μL不同浓度白芍总苷溶液，上室加入2 000个ASPC-1细胞悬液。组别和复孔的设置如方法“2.4”，在培养箱孵育48 h后，取出Transwell小室。清除未迁移上室细胞，用0.1%结晶紫浸染迁移至下室细胞。显微镜观察细胞并拍照。实验重复3次。

2.8 RT-qPCR检测MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表达水平 按密度5×105个/孔将对数生长期的ASPC-1细胞均匀铺在6孔板中，组别和复孔的设置如方法“2.4”。培养48 h后，分别加入TRIzol提取RNA，再参照一步法反转录荧光定量试剂盒检测MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表达情况，以GAPDH作为内参。用Beacon Designer 8软件设计特异性的引物。（见表1）RT-qPCR反应体系：2×onestep RT-qPCR Master Mix 10μL、正向引物（10μmol/L）0.4μL、反向引物（10μmol/L）0.4μL、RT enzyme Mix 0.65μL、RNA Template 1 ng、RNase free ddH2O至20μL。RT-qPCR反应程序：第一步，反转录50°C 5 min，1个循环；第二步，95℃预变性3 min，1个循环。第三步95℃变性10 s，退火/延伸/采集荧光信号60℃30 s，40个循环。RT-qPCR仪自动生成熔解曲线。每个样品进行3次重复，2-△△Ct的方法进行相对定量分析。

表1 RT-PCR引物信息

2.9 Western blotting检测MMP-2、MMP-9蛋白表达情况 按密度5×105个/孔将对数生长期的ASPC-1细胞均匀铺在6孔板中，组别和复孔的设置如方法“2.4”。培养48 h后，用RIPA裂解液冰上裂解20 min，4℃、13 000 r/min离心20 min，收集上清，采用BCA试剂盒蛋白定量。取30～40μg总蛋白进行SDS-PAGE，转膜，5%脱脂奶粉封闭，加入一抗（1:1 000～1:10 000）4℃过夜，再加入二抗（1:10 000）室温孵育1 h。最后用ECL曝光成像，凝胶成像系统分析结果。实验重复3次。

2.10 统计学方法 所有的数据均采用SPSS 25.0软件进行分析。计量资料采用（±s）表示，符合正态分布的计量资料，多组比较采用单因素方差分析，P〈0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 白芍总苷细胞毒性检测CCK8结果表明，当白芍总苷质量浓度大于100μg/mL时，ASPC-1细胞的存活率明显降低，表明白芍总苷浓度对ASPC-1细胞存活影响较大，因此选择25、50、100μg/mL这3个浓度进行后续实验。（见图1）

图1 不同浓度白芍总苷对ASPC-1细胞存活率的影响（±s，n=3）

3.2 白芍总苷对ASPC-1细胞增殖的影响C CK8结果表明，24 h白芍总苷中、高剂量组细胞增殖水平低于空白对照组（P〈0.05），白芍总苷低剂量组细胞增殖水平与空白对照组比较，差异无统计学意义（P〉0.05）；48、72 h白芍总苷低、中、高剂量组细胞增殖水平均低于空白对照组（P〈0.05），且白芍总苷浓度越高，细胞增殖速度下降越明显。（见图2）

图2 各组ASPC-1细胞OD450值比较（±s，n=3）

Western blotting和RT-qPCR结果显示，白芍总苷低、中、高剂量组ASPC-1细胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表达水平均低于空白对照组（P〈0.05），且呈剂量依赖性。（见图3）

图3 各组ASPC-1细胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表达水平比较

3.3 白芍总苷对ASPC-1细胞克隆形成能力的影响ASPC-1细胞给予白芍总苷干预后，白芍总苷低、中、高剂量组细胞克隆数均低于空白对照组（P〈0.05），且呈剂量依赖性。（见图4）

图4 白芍总苷对ASPC-1细胞克隆形成能力的影响

3.4 白芍总苷对ASPC-1细胞迁移和侵袭的影响 细胞划痕实验结果显示，白芍总苷低、中、高剂量组细胞划痕宽度明显宽于空白对照组（P〈0.05）。（见图5）细胞侵袭实验结果显示，白芍总苷低、中、高剂量组细胞穿过基膜的数量明显少于空白对照组（P〈0.05）。（见图6）

图5 各组ASPC-1细胞迁移能力比较

图6 各组ASPC-1细胞侵袭能力比较

3.5 白芍总苷对ASPC-1细胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达的影响 白芍总苷低、中、高剂量组细胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平均明显低于空白对照组（P〈0.05），且呈剂量依赖性。（见图7）

图7 各组ASPC-1细胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达比较

4 讨 论

白芍总苷（TGP）是一种潜在的抑癌剂。李湛全等[7]研究表明，白芍总苷联合天冬酰胺酶对人肝癌HepG2细胞、胃癌SGC-7901细胞和胃癌AGS细胞的增殖具有协同抑制作用。在前列腺癌中，白芍总苷可通过抑制炎症相关STAT3信号通路激活抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。此外，白芍总苷还可通过降低B细胞活化因子（BAFF）对n-亚硝基二乙胺（DEN）诱导的大鼠肝细胞癌具有抑制作用[6]。

本研究结果显示，不同浓度的白芍总苷能够降低胰腺癌细胞系ASPC-1的细胞活力，且呈剂量依赖性。同时，当白芍总苷质量浓度大于100μg/mL时，ASPC-1细胞的细胞存活率明显降低，因此，选择25、50、100μg/mL这3个质量浓度对胰腺癌细胞系ASPC-1进行后续实验。白芍总苷处理后，ASPC-1细胞的增殖活力降低，且迁移和侵袭能力下降。表明白芍总苷可抑制胰腺癌细胞系ASPC-1的增殖、迁移和侵袭。

肿瘤的形成是多因素、多阶段、多基因变异所致的复杂病变过程。已有的研究表明，细胞增殖失控是导致细胞癌变的重要机制之一。增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），又被称为周期素，位于人类第20号染色体，具有调控DNA合成步骤、修复损伤DNA、辅助DNA聚合酶δ与DNA链结合、调控细胞周期等作用[8-9]。KHAN S等[10]研究表明，奥美昔芬纳米颗粒通过抑制PCNA的表达来抑制胰腺肿瘤的生长。而SOHN E J等[11]研究表明，在胰腺癌中CCR4-NOT转录复合体亚基2（CNOT2）能上调PCNA表达促进肿瘤生长。由此可知，PCNA的表达水平与胰腺癌增殖状态呈正相关，能够准确反映胰腺癌细胞增殖状态。本研究表明，经白芍总苷处理后，ASPC-1细胞中PCNA mRNA和PCNA蛋白表达水平均降低，提示白芍总苷能通过下调PCNA的表达来抑制胰腺癌细胞的增殖。这与上述结论一致。

侵袭和转移是恶性肿瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌症患者死亡的根本原因。基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）是目前研究发现与侵袭转移有关酶最重要的一类[12-13]。本研究表明，经白芍总苷处理后，ASPC-1细胞中MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表达水平均降低，提示白芍总苷可以抑制MMP-2、MMP-9的表达。这与NAVEED等[14]研究结果一致，他们指出白芍总苷能抑制MMP-2、MMP-9的表达减轻小鼠心肌梗死后心肌重构。MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成员，能通过降解细胞外基质，导致肿瘤细胞侵袭转移。目前已有研究表明MMP-2和MMP-9在胰腺癌中高表达，且表达水平与胰腺癌临床分期、组织学分化、是否有淋巴结转移及肿瘤直径有关，下调MMP-9和MMP-2的表达可以抑制胰腺癌细胞侵袭转移的能力[15-17]。由此我们可以推测，白芍总苷能通过下调MMP-2、MMP-9的表达来抑制胰腺癌细胞侵袭转移的能力。

综上所述，本研究在分子和细胞层面揭示了白芍总苷抗胰腺癌的作用机制，为胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭提供体外实验证据。并为进一步寻找高效、低毒的抗肿瘤药物奠定了基础，值得进行深入研究。