一例伪狂犬病毒野毒株感染病例的病原学诊断

曾繁荣，尹家银，唐青海※，薛娇雄，喻 娇，刘雪晴，唐斯萍，杨 海，王芳宇

(1.湖南省衡阳市畜牧水产事务中心，湖南 衡阳 421008；2.南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室，衡阳师范学院生命科学与环境学院，湖南 衡阳 421008)

伪狂犬病（Pseudorabies，PR）是危害我国养猪业的主要病毒性之一，该病由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起。以往，PRV主要引起仔猪和母猪发病，但由于长期免疫压力、病毒变异，现今，不同日龄猪均易感，育肥猪亦可表现为呼吸道综合症、发育障碍、死亡率较高。尤其是自2011年以来，一种由伪狂犬病毒变异毒株引起较为严重的母猪繁殖障碍和初生乳猪死亡[1]。这些年来，我国普遍接种减毒活疫苗或基因缺失疫苗对PR的防控起到了显著效果，尽管如此，PRV野毒依然呈地方性的流行或散发[2,3]。最近的研究表明Bartha K61株活疫苗对流行变异毒株不能提供完全保护[4]，这给PR的防控提出了新的挑战。

本研究拟对一例育肥猪疑似PRV感染病例进行实验室检测、开展病原分离鉴定和病原培养特性研究诊断，为临床PR防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Vero细胞由南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室培养保存；PRV强毒阳性质粒和PRV阳性血清由衡阳市畜牧水产事务中心兽医实验室保存；血液/细胞/组织DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM培养基Thermo Fisher Scientific公司；Premix r Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司；HRP-SPA购自Invitrogen公司；AEC显色试剂购自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 病料采集与处理

某猪场育肥猪、体重约50kg、出现呼吸困难和死亡现象，结合免疫记录，怀疑为伪狂犬野毒株感染，随即采集发病猪的心脏、肺脏和脾脏，充分研磨，按照质量体积比为1:5的比例加入DMEM培养液充分悬浮均匀，于-80℃和37℃反复冻融3次，5000 r/min离心5 min，取上清，0.22μm滤膜过滤，滤液于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 DNA提取与PCR检测

取1.2.1中滤液200μL，用血液/细胞/组织DNA提取试剂盒提取DNA样本。根据文末参考文献[5]合成2对PRV特异性引物PRV-gE-F/R和PRV-gG-F/R，并参考文献[5]中的PCR体系和程序对心脏、肺脏和脾脏DNA进行PRV gE基因的PCR检测。

1.2.3 病毒分离培养与细胞病变观察

于病料接种前24小时，将Vero细胞按照1:6比例传代到25cm2的细胞培养瓶中，次日细胞贴壁且密度为70%～80%的汇合度时，弃掉培养液，加入1.2.1中的滤液1.5mL，轻轻摇匀覆盖细胞，置37℃、5%CO2培养箱中孵育1.5 h，轻轻吸出病毒液，补充含2%胎牛血清的DMEM培养基5mL，置37℃、5%CO2培养箱培养，每隔24 h观察1次，如发现细胞胀大、融合成合包体则为PRV特征性细胞病变效益（CPE）。

1.2.4 病毒的传代培养及PCR监测

收集第1代细胞培养物，反复冻融，取100μL接种到密度为80%左右、含2%胎牛血清的DMEM培养基的健康Vero细胞（25cm2的细胞培养瓶）轻轻摇匀进行传代培养。后续传代均按照这一方法进行。取第3代、第5代和第7代次的细胞培养上清200μL提取DNA，采用PRV特异性引物PRV-gE-F/R和PRV-gG-F分别检测gE和gG两个基因，检测方法如1.2.2步骤所述，设立健康细胞设定为阴性对照。

1.2.5 病毒在Vero细胞中的增殖动态

将Vero细胞接种到培养皿中，代细胞长满80%左右，将F7代病毒培养物，以50μL/皿，接种细胞，留1皿作为未接毒对照，37℃、5%CO2培养，在接毒后第4 h、第6 h、第8 h、第12 h和第24 h收1皿，根据文献[5]采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）检测病毒抗原。用PBS洗涤，真空干燥30 min，加入33%丙酮，固定1 h，真空干燥30 min，加入1.5 mL 1∶100倍稀释的PRV阳性血清，37℃、1 h。PBS洗涤3次。加入1∶3000倍稀释的酶标二抗HRP-SPA 1.5 mL，37℃、1 h，PBS洗涤3次，加入1.5 mL AEC底物显色液，37℃、15 min，显微镜观察结果。

2 结果

2.1 病料组织的PCR检测

PCR检测结果显示，病猪心脏、肺脏和脾脏组织为PRV-gE基因核酸阳性，阴对照和阳性对照成立（图1），说明病料为PRV野毒核酸阳性。

图1 病料组织中PRVg E基因的PCR检测

2.2 病毒细胞培养CPE观察

如图2所示，接种病料的Vero细胞在接种后48h出现明显细胞病变——细胞变圆、细胞融合成合胞体（图2-B箭头所指即为细胞融合的合胞体），未接种病毒对照细胞形态正常（图2-A）。

图2 病毒分离培养CPE观察（100倍）

2.3 病毒的传代培养物PCR监测

PCR结果显示，第3代、第5代和第7代次的细胞培养上清gG基因PCR扩增产物在250bp处有特异性条带、gE基因的PCR扩增产物在500bp处有特异性条带，阳性对照和阴性对照成立，说明第3代、第5代和第7代次的细胞培养上清为PRV阳性，病毒得到稳定传代繁殖。

图3 细胞传代培养物的PRVg E和gG基因PCR扩增

2.4 PRV在Vero细胞中的增殖动态

图4 分离病毒在Vero细胞中的增殖动态免疫染色检测

通过免疫染色，结果显示，感染后第4h无病毒特异性染色，感染后第6h一个视野下仅见个别细胞呈阳性染色，感染后第8h一个视野下出现数个细胞呈阳性染色，感染后第12h阳性染色细胞（细胞团）数显著增加，感染后第24h几乎所有细胞均呈病毒抗原阳性、且感染细胞均变圆或融合。表明所分离的病毒可以被PRV阳性血清特异性识别，分离病毒为PRV，且在感染细胞6h即可通过免疫染色检出。

3 讨论

通过PCR检测，发病猪的心脏、肺脏和脾脏组织样品均为PRVgE基因核酸阳性，说明该病毒为PRV野毒株。脾脏组织病理接种Vero细胞48h之后，细胞变圆并发生细胞融合为合胞体，这是PRV感染细胞的特征性CPE，与文献报道一致[6]。病毒在连续传代后，采用PCR监测gG和gE两个基因，结果显示，两个基因均为第3代、第5代和第7代次的细胞培养上清，且细胞病变形态一致，说明PRV在Vero细胞中进行了稳定的传代。以F7代病毒培养物为种子接种到Vero细胞，在不同时间点取样，进行免疫染色，结果发现，最早在接种病毒6h个别Vero细胞中PRV抗原阳性，说明PRV在Vero细胞中复制速度很快，12h时出现大面积阳性，24h大部分细胞呈PRV抗原阳性、且细胞已经大部分变圆，出现大面积细胞病变的时间比第一代提前了24h，可能跟持续传代病毒适应能力增强、病毒滴度上升有关。采用这种免疫染色的方法更特异性、更早地检出细胞中的PRV抗原。而文献多采用观察细胞病变来判断PRV增殖情况[6,7]，这一方法有两个不足，一方面时间有延后（一般需要24h），另一方面细胞病变形态的观察带有较强主观性，容易造成“因人而异”的结果。因此，本研究对PRV增殖动态的免疫学检测数据提示，在病毒感染早期（6h～12h）即可精确进行病毒检测，既缩短了检测时间又减少了对CPE的主观误判，可为疫苗生产中PRV抗原检测提供有价值的参考。

综上所述，本研究成功对一例临床PRV疑似病例的病原进行了实验室的鉴定，并成功分离鉴定了PRV病毒，阐明了该毒株在Vero细胞中的增殖动态，对于临床PRV防控和PRV疫苗生产质量检定具有一定的借鉴意义。